腦脊液中Dickkopf-1的表達與肺腺癌軟腦膜轉移發生發展及耐藥性的相關性分析

俞婷婷 鄭勝男 蔣澄 謝宇 尹震宇 郭愛斌 李會穎

軟腦膜轉移(leptomeningeal metastasis，LM)是肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)最嚴重的并發癥之一[1]。目前臨床上針對LM主要存在兩個瓶頸，一是LM缺乏有效治療手段；二是沒有特異性標志物可用于LM早期診斷、療效監測和預后評估。既往研究發現外周血中分泌型糖蛋白Dickkopf-1(DKK1)在肺癌早篩、診斷和預后等方面具有潛在應用價值[2-3]。對LM患者而言，腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)樣本比血液樣本更能準確地表征顱內腫瘤的真實狀態[4-5]。目前還沒有關于LUAD伴LM患者CSF中DKK1表達情況的研究報道。因此，本研究通過比較LUAD伴LM患者與非瘤對照者CSF中DKK1的表達差異，以及鞘內化療期間DKK1動態變化情況，首次探討分析了DKK1與LM的發病、耐藥性、預后相關性，以期能為LM個體化治療提供可靠指標，同時為難治型LM患者尋找更有針對性的靶點提供新思路和理論依據。

資料與方法

一、資料來源

本研究篩選了2019年12月至2021年05月期間就診于南京鼓樓醫院的經病理明確診斷的LUAD患者，經頭顱(magnetic resonance imaging，MRI)或腦脊液細胞學明確診斷為LM，進行規律的培美曲塞鞘內化療，最終入組20例患者。此外，納入非瘤對照患者10例。所有入選患者均簽署知情同意書，本院醫學倫理委員會審批(2019-263-02)并同意開展本研究。

二、臨床樣本的收集

將研究對象分為對照組(Con組)和LM組，LM組依據RANO(Response Assessment in Neuro-Oncology)療效評價標準具體分為：疾病穩定(stable disease，SD)，部分緩解(partial response，PR)，完全緩解(complete response，CR)和疾病進展(progressive disease，PD)。為便于后續的統計分析，本研究將療效評價為PR、CR和SD的患者統一歸入于疾病控制(disease control，DC)組。DC組的樣本按照治療周期的不同具體分為：DC-0C組(鞘內化療前)，DC-2C組(兩周期鞘內化療后)，DC-4C組(四周期鞘內化療后)。

主要的納入標準：年齡18歲至75歲；初診經病理診斷為肺腺癌，且經臨床、病理、影像學評估確診為肺癌軟腦膜轉移，至少有一個可評價病灶；美國東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)評分≤3分；無明顯出血癥狀、出血性疾病及血栓性疾病；無明顯心肝腎功能異常。主要的排除標準：對培美曲塞過敏或禁忌癥患者；無法控制的癲癇；同時或既往有其它腫瘤病史；妊娠、哺乳期婦女。

入組患者經充分評估后行規律的培美曲塞鞘內化療。詳細收集患者相關的臨床、病理、影像學資料。每2周期鞘內化療后復查頭顱+全脊柱磁共振、胸部CT、腫瘤標志物等，結合患者癥狀，參照RANO標準判斷治療療效。收集LM患者治療前后不同時間點的腦脊液標本6～10mL，對照組經腰椎穿刺留取腦脊液6～10mL。所有樣本統一保存于-80℃冰箱中。

對所有入組患者進行隨訪，記錄患者的無進展生存期(progression-free survival，PFS)。PFS為從鞘內化療之日起至疾病發生進展或觀察截止時間(2021年05月)為止，生存期以月表示。

三、檢測方法

所用試劑與儀器：Human DKK1 Quantikine ELISA Kit 定量檢測試劑盒為美國R&D Systems產品(DKK100B)，最低檢測值：0.948pg/mL，檢測范圍：9.4～600.0pg/mL，酶標儀為Tecan公司產品。

使用前將ELISA試劑盒和CSF樣品平衡至室溫，按照試劑盒說明書具體操作如下：①每孔加入50μL樣本稀釋液；②每孔分別加入標準品、對照或CSF樣本50μL，封板，室溫溫育120min；③自動洗板機洗板4次；④加入酶結合物200μL，室溫溫育120min后洗板4次；⑤每孔加入底物液200μL，室溫避光顯色30min；⑥加入終止液50μL，于30min內用酶標儀分別在450nm、540nm處測定各孔的吸光度值OD450、OD540值。儀器軟件根據已知的標準品濃度和OD450、OD540值作出標準曲線，求出標準方程，通過樣本OD450、OD540值計算濃度。

四、統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。DKK1濃度與PFS呈非正態分布，用M(Q1,Q3)表示，多組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗；計數資料應用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。根據受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)及曲線下面積(the area under ROC curve，AUC)評估腦脊液中DKK1濃度診斷的敏感性和特異性。

結 果

一、基本情況

共納入20例LUAD伴有LM的患者，年齡33～62歲，中位年齡48.4歲，男10例，女10例，男女比例1：1，共11 (55%)例，有吸煙史。基礎突變中，共10 (50%)例，患者為EGFR L858R突變，4 (20%)例，為EGFR Del-19突變，另外6 (30%)例，為間變性淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 突變。從診斷為LUAD至發生LM，時間為8～63個月，中位時間25個月；診斷LM時患者的ECOG評分為1～3分。20例患者入組前評估肺部原發灶均穩定，6(30%)例合并腦實質轉移 (brain metastasis, BM)，其中5例曾行全腦放療 (whole brain radiation therapy, WBRT)。此外，大部分患者曾接受過培美曲塞聯合鉑類的雙藥化療(17/20，85%)以及抗血管生成治療(16/20，80%)。為加強顱外病灶的控制、發揮協同抗腫瘤的效果，鞘內化療的同時患者均口服靶向藥物，從而確保入組患者的最大生存獲益，主要包括奧希替尼(Osimertinib)和勞拉替尼(Lorlatinib)。相關內容(見表1)。

表1 LUAD伴LM患者的基本情況[n(%)]

二、CSF中DKK1的表達

20例LUAD患者CSF中DKKl含量較10例非瘤對照升高，兩組間差異有統計學差異(P<0.05)(圖l，表2)。DC亞組及PD亞組較對照組DKK1表達均上調，但PD組升高更為顯著(P<0.05)(圖2，表2)。DKKl的表達與患者年齡、性別、吸煙史、ECOG評分、基礎突變類型、發生腦膜轉移的時間、是否合并腦實質轉移、全腦放療史、化療史、抗血管生成治療史、TKIs類型等均無統計學意義的相關性(P>0.05)。在DC組鞘內化療的過程中，DKKl的表達水平整體呈現不斷下降的趨勢，其中DC-0C組與DC-4C組差異存在統計學差異(P<0.05)(圖3，表3)。ROC分析表明診斷LUAD-LM的最佳CSF中DKK1臨界濃度為139.36pg/mL，此時其敏感性為70%，特異性為80%，AUC為0.745(圖4)。

圖3 DC組患者不同治療周期后的CSF中DKK1的表達

圖4 LM組和對照組患者CSF中DKK1濃度ROC分析

表2 鞘內化療前各組CSF中DKK1濃度對比

圖1 LM組與對照組CSF中DKK1濃度對比

圖2 鞘內化療前各組CSF中DKK1的不同表達

表3 DC組患者不同治療周期后CSF中DKK1濃度的動態變化

三、DKK1的表達與預后

DC組患者PFS為4.5～11個月，中位PFS為6個月，PD組PFS為1～6.5個月，中位PFS為2.25個月，兩者之間存在明顯差異(P<0.01)。以139.36pg/mL為截斷點，DKK1高表達組(16/20)患者PFS為1～8.5個月，中位PFS為4.5個月；低表達組(4/20)患者PFS為4.5～11個月，中位PFS為7.25個月，兩組的PFS比較差異具有顯著性(P<0.05)。關聯性分析顯示，CSF中DKK1和PFS之間有顯著相關性(Pearson相關系數為-0.528，P=0．017)。PFS與患者年齡、性別、吸煙狀況、ECOG評分、基礎突變、發生腦膜轉移的時間、有無合并腦實質轉移、既往治療史、合并TKIs等均無統計學意義的相關性(P>0.05)。

討 論

目前LUAD伴LM的治療仍較為棘手，早期的診斷及精準的調整個體化的治療方案對改善預后至關重要，但目前臨床上仍缺乏靈敏診斷、動態療效監測的有效方法。腦脊液細胞學是目前LM診斷的金標準，具有100%的特異性，但是由于技術水平、樣本量有限等諸多原因，存在較多的假陰性，靈敏度僅75%，并且無法有效反應治療過程中的療效[6]。頭顱及全脊柱MRI是另外一個重要的診斷手段，但是由于LM病灶可隨著CSF循環彌散在整個中樞系統內，較少形成實性的腫瘤病灶，很多患者在疾病前期MRI無法顯示，敏感性僅有70%，而且在治療前后也無法對比病灶的大小評估療效[7]。腦脊液的常規、生化檢測及腫瘤標志物由于較低的敏感性和特異性，臨床上僅作為輔助的診斷指標[8]。因此，臨床上迫切需要一種更為可靠的特異性標志物。

Dickkopf(DKK)蛋白家族主要包括DKK1-4四種亞型，其中DKK1為一種分泌型糖蛋白可以抑制Wnt信號通路[9]。Wnt信號通路在生物進化過程中高度保守，可通過Wnt/β-catenin信號通路調控細胞的生長、發育和分化，已被證實與多種腫瘤的發生密切相關[9-11]。值得注意的是，DKK1在不同癌癥中卻發揮著截然不同的作用[9]。一些研究證實DKK1是一種抑癌基因，在乳腺癌、腸癌等腫瘤組織中低表達，可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制癌細胞增殖和轉移[9]。與此相反，DKK1被發現可以促進肺癌的發生、發展，在肺癌患者的肺癌組織和血清中DKK1呈現高水平的表達[3]。但是目前尚無肺癌LM患者腦脊液中DKK1表達情況的相關研究。

BBB的存在使得顱內轉移灶具有獨特的局部微環境，因此相較于血液、胸水等，CSF是LM更為準確的液體活檢樣本[4-5]。我們首次對DKK1的表達情況及動態變化進行系統的檢測，經各組的差異性分析有如下發現：(1)DKK1的表達水平在LM組和對照組CSF中存在顯著差異，提示DKK1與LM的發生密切相關，并可作為LM診斷的潛在標志物，擁有較好的敏感性和特異性；(2)與DC組基線狀態相比，兩周期和四周期鞘內化療后的LM患者CSF外泌體中DKK1的表達水平逐漸下降，說明DKK1與LM的鞘內治療緊密相關，可能成為監測療效的可靠指標；(3)相比于DC組，PD組中DKK1上調更為顯著，DKK1高表達組PFS劣于低表達組，進一步說明DKK1與LM耐藥性、不良預后相關。因此，上述研究結果均提示CSF中的DKK1對LUAD伴LM的發生和發展發揮了重要的作用。

既往有研究表明在非小細胞肺癌中，DKK1可抑制β-catenin的磷酸化，導致細胞質中游離的非磷酸化β-catenin增多、核定位增加，β-catenin進入細胞核中與T細胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancer factor，LEF)復合物相結合，激活下游靶基因，進而促進肺癌的發生、發展與轉移[12]。例如，β-catenin核定位增加，可促進上皮間質轉化(epithelia mesenchymal transition，EMT)的發生[12]，導致肺癌細胞的增殖、轉移及耐藥性，因此我們推測這可能與LM的發生及耐藥相關，有待后續相關研究進一步證實。

綜上所述，本研究通過檢測分析LM患者CSF中DKK1的表達及動態變化，首次證實，其與LM的發生、發展及耐藥密切相關，在指導用藥、監測耐藥、評估療效及判斷預后等方面具有廣泛的應用前景。本研究樣本量有限，后續將進一步擴大樣本量驗證相關結論，以期為LUAD伴LM尋找可靠的早期診斷、預后評估指標及新的防治策略，推進更為精準的個體化的腫瘤治療。