蝴蝶蘭組織培養(yǎng)再生體系的建立

張清鳳 趙 潔 普 春 李啟菊 馬梅見

（昭通市農(nóng)業(yè)科學院，云南昭通 657000）

蝴蝶蘭又稱蝶蘭，為熱帶多年生名貴花卉，花色品種多，形態(tài)美妙，花大色艷，花期持久，一般可達2～3個月，最長可達半年，在熱帶蘭種中素有“蘭花皇后”的美稱[1-2]。蝴蝶蘭是一種高檔商品蘭花，適于家庭擺設或裝扮花籃等。

蝴蝶蘭屬于單莖性氣生蘭，過去一般依靠摘心發(fā)出葉芽進行繁殖，但該方法對植株損害很大，現(xiàn)在較少采用[2]。蝴蝶蘭植株極少發(fā)育側(cè)枝，比其他種類的蘭花更難進行常規(guī)無性繁殖[3]。應用植物組織培養(yǎng)技術進行蝴蝶蘭快速繁殖可以縮短繁育周期，獲得大量成株，并且可以保持優(yōu)良性狀，維護種質(zhì)資源，從大量的繁殖后代中獲得一定數(shù)量的突變體[4]。目前，蝴蝶蘭快繁途徑主要有：利用各種外植體誘導類原球莖，進而誘導分生苗實現(xiàn)快繁[5-6]，不經(jīng)愈傷組織直接誘導叢生芽[5，7]。

本文對蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程中的一系列關鍵技術進行研究，以期篩選出蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的最優(yōu)技術參數(shù)，建立蝴蝶蘭離體培養(yǎng)再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蝴蝶蘭莖尖較難剝離，且易傷植株，因而本試驗選用蝴蝶蘭的葉片及根尖作為外植體來誘導原球莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基篩選。為了篩選誘導原球莖較好的培養(yǎng)基，研究人員開展了培養(yǎng)基篩選試驗。試驗設9個處理，具體見表1。取蝴蝶蘭幼嫩葉片進行原球莖誘導，培養(yǎng)溫度為24℃，光照強度為1 000 lx，光照時長為12 h/d，培養(yǎng)時間為40 d。

表1 培養(yǎng)基設計 單位：（mg·L-1）

1.2.2 不同外植體對原球莖形成的影響。以H培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，各選取葉片、根尖外植體60個，研究不同外植體對原球莖形成的影響。培養(yǎng)溫度為24℃，光照強度為1 000 lx，光照時長為12 h/d，培養(yǎng)時間為40 d。

1.2.3 溫度和光照條件對原球莖形成率的影響。以葉片作為外植體，設置不同溫度和光照條件，研究溫度和光照條件對原球莖形成率的影響。試驗設6個處理，具體見表2。培養(yǎng)時間為40 d。

表2 溫度和光照條件設計

1.2.4 活性炭與抗壞血酸對抑制褐變的作用。采用活性炭與抗壞血酸抑制褐變的產(chǎn)生，設6個處理，具體見表3。培養(yǎng)溫度為24℃，光照強度為1 000lx，光照時長為12 h/d，培養(yǎng)時間為40 d。

表3 抑制褐變處理設計 單位：（g·L-1）

1.2.5 不同濃度6-BA對原球莖增殖的影響。在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中，要達到快速繁殖的目的，必須加快原球莖增殖速度。在原球莖球體階段進行增殖是最理想的方法。在原球莖形成以后，分別轉(zhuǎn)移到添加1.0、2.0、3.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中進行增殖。培養(yǎng)溫度為24℃，光照強度為1 000 lx，光照時長為12 h/d，培養(yǎng)時間為60 d。

1.2.6 6-BA、NAA對試管苗生成的影響。蝴蝶蘭原球莖轉(zhuǎn)化成試管苗所用的培養(yǎng)基是H培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA和NAA，研究6-BA、NAA對試管苗生成的影響。試驗設9個處理，具體見表4。培養(yǎng)溫度為24℃，光照強度為2 000 lx，光照時長為12 h/d，培養(yǎng)時間為40 d。

表4 不同濃度6-BA、NAA設計 單位：（mg·L-1）

1.2.7 不同濃度NAA對蝴蝶蘭生根的影響。采用H培養(yǎng)基，分別添加 0.1、0.5、1.0 mg/L NAA，研究其對蝴蝶蘭生根的影響。培養(yǎng)溫度為24℃，光照強度為2 000 lx，光照時長為12 h/d，培養(yǎng)時間為40 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基篩選

由表5可看出：處理H1誘導出的原球莖最多，形成球狀體的外植體百分比最高，為46.7%；處理MS1次之，形成球狀體的外植體百分比為36.7%；處理VW1排第三，形成球狀體的外植體百分比為30.0%。

表5 不同培養(yǎng)基對蝴蝶蘭葉片原球莖狀球體形成率的影響

2.2 不同外植體對原球莖形成的影響

如表6所示，葉片的原球莖形成率為56.67%，根尖的原球莖形成率為7.50%，說明用葉片作外植體誘導原球莖的效果好于根尖。

表6 不同外植體對原球莖形成的影響

2.3 溫度和光照條件對原球莖形成率的影響

如表7所示，處理B2為最優(yōu)處理，即在溫度為24℃、光照強度1 000 lx、光照時長12 h/d的培養(yǎng)條件下，外植體易誘導形成原球莖球狀體，原球莖形成率達到了46.7%。

表7 溫度和光照條件對蝴蝶蘭原球莖形成率的影響

2.4 活性炭與抗壞血酸抑制褐變效果比較

蝴蝶蘭外植體接種后容易褐變，培養(yǎng)體褐變后基本上就死亡了。因此，抑制褐變產(chǎn)生也是培養(yǎng)成功的關鍵。如表8所示，活性炭和抗壞血酸對抑制褐變產(chǎn)生都有一定的作用。處理T1、T2、T3抑制效果較好，產(chǎn)生褐變外植體的百分比為20%～30%，遠低于處理S1、S2、S3，且處理 T1、T2、T3組培苗長勢也比較好。

表8 活性炭與抗壞血酸抑制褐變效果比較

2.5 6-BA對原球莖增殖的影響

試驗發(fā)現(xiàn)：當6-BA濃度為1.0 mg/L時，原球莖長勢較差，數(shù)目較少，且一部分分化成小苗；當6-BA濃度為3.0 mg/L時，原球莖增殖數(shù)目較多，但其中有許多發(fā)生了變異；當6-BA濃度為2.0 mg/L時，原球莖長勢較為旺盛，且無變異，分化成小苗的也較少。

2.6 6-BA、NAA對試管苗生成的影響

如表9所示：處理3形成試管苗的百分比最多，達88%；處理9次之，形成試管苗的百分比達76%；處理7最少，形成試管苗的百分比達10%。

表9 6-BA、NAA對試管苗生成的影響

2.7 不同濃度NAA對蝴蝶蘭生根的影響

如表10所示，當NAA濃度為1.0 mg/L時，蝴蝶蘭生根數(shù)量最多，生根率達100%。

表10 不同濃度NAA對蝴蝶蘭生根的影響

3 結(jié)論與討論

在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中，H培養(yǎng)基對蝴蝶蘭葉片原球莖的誘導效果好于其他培養(yǎng)基。葉片誘導原球莖的效果好于根尖誘導的原球莖。溫度24℃、光照強度1 000 lx、光照時長12 h/d的培養(yǎng)條件較適合原球莖生長。在培養(yǎng)過程中加入適量活性炭不僅能有效地抑制褐變產(chǎn)生，而且可起到壯苗作用。在原球莖增殖中，6-BA濃度為2.0 mg/L時增殖效果好。當6-BA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.1 mg/L時，形成的試管苗數(shù)量最多。當NAA濃度為1.0mg/L時，生根數(shù)最多。

在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中，切塊較大的外植體組織培養(yǎng)成功的概率大于切塊小的外植體。幼嫩的根尖、葉片更容易誘導出原球莖，且褐變率較少，同時，在外植體培養(yǎng)初期進行1周的暗培養(yǎng)也可以減少褐變發(fā)生。在切塊細小、稀疏的培養(yǎng)瓶內(nèi)，群體生長較慢，而在切塊較大且密集的培養(yǎng)瓶內(nèi)，群體生長旺盛，表現(xiàn)出一定的群體生長效應[3]。另外，在培養(yǎng)過程中加入適量的椰乳、香蕉可增加培養(yǎng)的成功率。蝴蝶蘭的實驗室資源保存以原球莖繼代培養(yǎng)方式為宜，但時間不能太長，最多2～3年，之后要進行原球莖的重新誘導，以免產(chǎn)生變異植株。