姜黃素聯合乙二胺四乙酸對熒光假單胞菌的光動力滅活作用

王 洋，趙瑜玲，陳孟涵，張錦錦，臧明伍，趙紫華，郝建雄，韓俊華,*

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）屬于假單胞菌屬，廣泛分布于自然界中，在4 ℃條件下能快速生長繁殖，是果蔬、乳、肉等食品中一種常見的嗜冷性腐敗菌。它能夠產生極耐熱的蛋白酶和脂肪酶，這些酶即使在高溫下也難以滅活，在食品貯藏過程中嚴重影響食品的風味、口感、組織狀態等，并能在食品、食品加工設備及包裝材料等表面形成生物膜，對食品持續進行污染[1]，嚴重危害食品質量與安全。

光動力滅活（photodynamic inactivation，PDI）因其高效、經濟、環保的優點成為食品行業的一種新型殺菌方法[2]。PDI過程是一種光物理和光化學反應，需要氧氣、可見光和光敏劑同時存在[3]。目前，已經發現并合成了許多新型光敏劑，包括抗菌光敏劑、抗癌光敏劑等[4]。在這些光敏劑中，姜黃素因具有成本低、安全性高、殺菌效果好等特點而被廣泛應用[5-7]。姜黃素是從姜黃根莖中提取出的一種植物多酚化合物，常被用作天然色素或膳食補充劑[8-9]，其可在藍光（400～500 nm）下被激發而產生活性氧[10]。此外，姜黃素的光激發還可以產生姜黃素自由基，從而導致嚴重的DNA損傷[11]。基于姜黃素光動力作用的殺菌技術在食品貯藏和保鮮方面已顯示出巨大的應用潛力。例如，姜黃素介導的PDI已成功應用于鮮切蘋果[12]和梨[13]的保鮮。到目前為止，已有諸多研究者嘗試利用PDI替代或輔助傳統殺菌技術[14-16]。

本實驗探究以姜黃素為光敏劑的PDI技術對果蔬、乳品及肉品中的優勢嗜冷菌——熒光假單胞菌的滅活效果；分析乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對姜黃素介導PDI的協同增效作用；采用自行研制的小型光動力設備進行新鮮豬肉的PDI處理，初步分析自制設備的保鮮效果，從而為姜黃素介導的PDI在食品領域中的應用提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌由本課題組分離自原料乳中，現保藏于河北科技大學食品生物技術與食品安全實驗室；新鮮豬肉購于石家莊市北國超市。

姜黃素（純度99%） 山東西亞化工有限公司；殼聚糖（脫乙酰度≥95%） 上海阿拉丁試劑有限公司；EDTA 天津市永大化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉、無水乙醇均為分析純；實驗用水為無菌去離子水。

1.2 儀器與設備

YT-CJ-1N超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術有限公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 常州市國旺儀器制造有限公司；TGL-16C高速離心機 上海安亭科學儀器廠；SPX-100B-Z生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BM-103CE生物顯微鏡 廈門麥克奧迪實業集團有限公司；BS600＋電子天平 上海友聲衡器有限公司；CR-400色差儀 深圳市歐亞精密儀器有限公司；pH211哈納酸度計 北京泰亞賽?？萍及l展有限公司。

實驗用PDI裝置（裝置1）為實驗室自制，由96 孔板、LED燈珠（3.0～3.2 V、2.0 mA、460 nm）、LED調光器等組成，光功率密度為200 mW/cm2。

小型應用型PDI裝置（裝置2）為實驗室自制，由箱體（40 cm×40 cm×40 cm）、LED燈條（12～24 V、460 nm）、變壓器等組成，光功率密度為100 mW/cm2。

1.3 方法

1.3.1 熒光假單胞菌的培養

將熒光假單胞菌（-20 ℃保存于25%（體積分數）甘油管中）接種于LB液體培養基中，28 ℃、150 r/min搖床恒溫培養24 h，按照2%（體積分數）進行傳代，同樣條件下培養24 h，10 000×g離心5 min，收集菌體，用無菌生理鹽水清洗2 次并稀釋至濃度約1×108CFU/mL，備用。

1.3.2 光敏劑配制

稱取0.036 8 g姜黃素，用無水乙醇定容至100 mL，得到1 mmol/L的姜黃素母液。取0.5 g殼聚糖置于燒杯中，加入99 mL無菌去離子水，不斷攪拌，再加入1 mL冰醋酸使殼聚糖充分溶解，得到0.5%（質量分數，下同）的殼聚糖溶液。以此殼聚糖溶液為溶劑稀釋姜黃素母液，配制濃度分別為5、25、50、75、100 μmol/L的姜黃素溶液，并在60 ℃恒溫水浴鍋中避光孵育15～20 min，避光保存備用。

1.3.3 姜黃素聯合EDTA的PDI條件確定

1.3.3.1 姜黃素濃度

按照200 μL/孔在48 孔板中加入1.3.1節熒光假單胞菌菌懸液，然后按照100 μL/孔分別加入0.5%（質量分數，下同）EDTA溶液，孵育10 min（室溫，下同），再按照200 μL/孔加入不同濃度（0（對照組）、5、25、50、75、100 μmol/L）的姜黃素溶液，避光孵育10 min，隨后放入裝置1光照20 min，光照結束后，每孔取100 μL混合液涂布于LB固體培養基，27 ℃恒溫培養24 h后進行菌落計數。

1.3.3.2 光照時間

按照200 μL/孔在48 孔板中加入1.3.1節熒光假單胞菌菌懸液，然后按照100 μL/孔分別加入0.5% EDTA溶液，孵育10 min后按照200 μL/孔加入75 μmol/L姜黃素溶液，避光孵育10 min，隨后放入裝置1分別光照0（對照組）、5、10、20、30、40 min，光照結束后，每孔取100 μL混合液參照1.3.3.1節方法測定菌落數。對照組不進行光照。

1.3.3.3 EDTA質量分數

按照200 μL/孔在48 孔板中加入1.3.1節熒光假單胞菌菌懸液，然后按照100 μL/孔分別加入不同質量分數（0（對照組）、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）的EDTA溶液，孵育10 min后按照200 μL/孔加入75 μmol/L的姜黃素溶液，避光孵育10 min，利用裝置1光照20 min，光照結束后，每孔取100 μL混合液參照1.3.3.1節方法測定菌落數。

1.3.4 姜黃素聯合EDTA對熒光假單胞菌生物膜的PDI作用分析

1.3.4.1 顯微鏡觀察熒光假單胞菌生物膜

按照2 mL/孔在6 孔板（放置了20 mm×20 mm的玻璃蓋玻片）中加入LB液體培養基，同時每孔加入200 μL 1.3.1節熒光假單胞菌菌懸液，于27 ℃下恒溫培養，分別在0、6、12、24、36、48、60、72 h用無菌鑷子將蓋玻片取出，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）沖洗數次蓋玻片以除去浮游菌，然后用無水甲醇固定10 min，隨后用PBS沖洗3 次，自然干燥。在蓋玻片表面滴加1.0%（質量分數）結晶紫染液，靜置2 min，用PBS洗去多余染液，自然干燥后置于生物顯微鏡下觀察生物膜，放大倍數100 倍。

1.3.4.2 PDI處理玻璃表面熒光假單胞菌生物膜

按1.3.4.1節方法培養72 h后，將附著有熒光假單胞菌生物膜的蓋玻片取出，用無菌水沖洗除去表面浮游細菌后置于6 孔板中。75 μmol/L姜黃素-0.5% EDTA組加入0.5 mL 0.5% EDTA溶液，孵育10 min后加入1 mL 75 μmol/L的姜黃素溶液，避光孵育10 min；75 μmol/L姜黃素組加入0.5 mL無菌水，孵育10 min后加入1 mL 75 μmol/L的姜黃素溶液，避光孵育10 min；0.5%殼聚糖組加入0.5 mL無菌水溶液，孵育10 min后加入1 mL 0.5%殼聚糖溶液，避光孵育10 min；0.5%殼聚糖-0.5% EDTA組加入0.5 mL 0.5% EDTA溶液，孵育10 min后加入1 mL 0.5%殼聚糖溶液，避光孵育10 min；空白組加入1.5 mL無菌水，孵育10 min。將6 孔板于裝置1中光照0、20 min，然后吸取100 μL混合液參照1.3.3.1節方法測定菌落數。

1.3.4.3 PDI處理丙烯腈二乙烯丁二烯樹脂板表面熒光假單胞菌生物膜

參照1.3.4.1節生物膜的制備方法，用厚度為0.5 mm的丙烯腈二乙烯丁二烯樹脂（acrylonitrile-butadienestyrene，ABS）方格板（4 cm2）代替玻璃蓋玻片。生物膜培養完成后按照1.3.4.2節方法進行分組和處理，測定處理后的菌落數。

1.3.5 新鮮豬肉PDI處理效果分析

1.3.5.1 新鮮豬肉的PDI處理

將新鮮豬肉用無菌水清洗后用吸水紙將豬肉表面水分吸干，在超凈臺中將其切分成豬肉片（4.0 cm×4.0 cm×0.5 cm），采用體積分數75%乙醇溶液浸泡5 min，進行表面殺菌，用無菌水沖洗3 次，置于超凈臺中風干5 min。吸取100 μL熒光假單胞菌菌懸液（取1.3.1節熒光假單胞菌菌懸液調整濃度約6.0×107CFU/mL）均勻涂抹在豬肉片表面，靜置30 min，使熒光假單胞菌充分黏附。空白組、殼聚糖對照組、PDI組分別在豬肉片表面均勻噴灑0.5 mL無菌水，PDI＋EDTA組噴灑0.5 mL 0.5% EDTA，孵育10 min；然后空白組噴灑1.0 mL無菌水，殼聚糖對照組噴灑1.0 mL 0.5%殼聚糖溶液，PDI＋EDTA組和PDI組分別噴灑1.0 mL 75 μmol/L姜黃素，避光孵育10 min后，將PDI＋EDTA組和PDI組樣品置于裝置2中光照處理20 min。處理完成后，各組樣品于4 ℃下貯藏。

1.3.5.2 豬肉熒光假單胞菌菌落數的測定

取貯藏第0、1、3、7、10天的豬肉，參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》測定豬肉表面熒光假單胞菌菌落數。

1.3.5.3 豬肉質量損失率的測定

在處理前用電子天平稱量樣品質量m0/g，PDI處理后，用吸水紙將各組樣品表面的水吸干，稱量貯藏0、3、6、9 d后的樣品質量m1/g，精確至0.01 g，按式（1）計算質量損失率。

1.3.5.4 姜黃素溶液和豬肉色澤的測定

在24 孔板各孔中加入1 mL濃度分別為5、25、50、75、100 μmol/L的姜黃素溶液，在裝置1中照射20 min，同時設置未光照組，對光照前后姜黃素溶液的顏色變化進行拍照觀察。

參照1.3.5.1節方法切分豬肉，立即測定樣品的亮度（L*值）、紅綠度（a*值）、黃藍度（b*值），在豬肉片（4.0 cm×4.0 cm×0.5 cm）表面噴灑0.5 mL 0.5% EDTA，孵育10 min，然后分別噴灑1.0 mL不同濃度（5、50、75 μmol/L）姜黃素溶液，對照組噴灑等體積無菌水，避光孵育10 min后，立即將樣品置于裝置2中光照處理20 min。處理完成后，各組樣品于4 ℃下貯藏。

取光照處理后貯藏第0、3、6、9、12天的豬肉，采用色差儀分別測定各處理樣品的L*、a*、b*值，并按式（2）計算色差（ΔE）。

式中：L*、a*、b*值分別表示樣品貯藏一定時間的亮度、紅綠度、黃藍度；值分別表示樣品在第0天光照處理前的亮度、紅綠度、黃藍度。

1.3.5.5 豬肉pH值的測定

取1.3.5.1節貯藏第0、2、4、6、10天的豬肉，根據GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》測定豬肉的pH值。

1.4 數據統計與分析

實驗中每組樣品設置3 個平行，數據以平均值±標準差表示。采用SPSS Statistics 24.0軟件對實驗所得數據進行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用OriginPro 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 PDI對熒光假單胞菌的滅活作用

2.1.1 姜黃素濃度對PDI作用的影響

姜黃素濃度對熒光假單胞菌的PDI作用的影響如圖1所示。隨著姜黃素濃度的增加，熒光假單胞菌的菌落數明顯降低。當姜黃素濃度為5 μmol/L時，與對照組相比，熒光假單胞菌菌落數對數值減小1.84（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；隨著姜黃素濃度的增大，對熒光假單胞菌的PDI效果也隨之增強，當姜黃素濃度增加至75 μmol/L時，PDI效果達到最大，熒光假單胞菌菌落數對數值減小7.46（lg（CFU/mL）），滅活效果顯著強于其他組（P＜0.05）。姜黃素濃度為100 μmol/L時，對熒光假單胞菌的滅活效果不再增強，反而略有降低。推測原因可能是，姜黃素濃度過高時，藍光的照射劑量有限，部分姜黃素未能吸收藍光而不能發生光敏化，從而影響PDI效果；也可能是姜黃素濃度增加到一定程度時，會在熒光假單胞菌細胞內外形成動態平衡，阻礙姜黃素進一步進入細胞，從而降低PDI效果[17]。于金珅[18]在研究姜黃素濃度對鮮切馬鈴薯表面大腸桿菌PDI效果的影響時也發現，在姜黃素濃度為30 μmol/L時，對大腸桿菌表現出最佳殺菌效果，進一步提高姜黃素濃度，殺菌效果反而下降，本研究結果與之相似。綜上，選擇75 μmol/L的姜黃素溶液進行后續PDI處理。

圖1 姜黃素濃度對熒光假單胞菌菌落數的影響Fig. 1 Effect of curcumin concentration on total count of P. fluorescens

2.1.2 光照時間對PDI作用的影響

光照時間對熒光假單胞菌的PDI作用的影響如圖2所示。光照時間對熒光假單胞菌的PDI效果影響顯著，且呈現出隨光照時間延長先增強后減弱的趨勢。光照時間為20 min時，光動力殺菌效果達到最佳，選擇此條件進行后續實驗。與對照組相比，熒光假單胞菌菌落數對數值顯著減小6.40（lg（CFU/mL））（P＜0.05）。隨著光照時間的繼續延長，滅活效果反而減弱。實驗結果表明，并非光照時間越長殺菌效果越好，這可能是光照時間過長導致周圍環境的溫度升高，更有利于熒光假單胞菌的生長繁殖[19]。因此，PDI技術在進行工業化應用時，應在保證殺菌效果的同時，盡量縮短光照時間，力求在符合生產標準的前提下滿足殺菌要求，提高生產效率。綜上，選擇光照20 min進行后續PDI處理。

圖2 光照時間對熒光假單胞菌菌落數的影響Fig. 2 Effect of illumination time on total count of P. fluorescens

2.1.3 EDTA質量分數對PDI作用的影響

革蘭氏陰性菌細胞壁外層含有脂多糖層，相對于革蘭氏陽性菌更能耐受PDI處理[5]。EDTA作為一種金屬螯合劑能夠螯合革蘭氏陰性菌表面穩定生物膜基質所需的二價金屬離子[20]，會破壞革蘭氏陰性菌細胞外膜[21]。已有報道稱EDTA可以增加非陽離子光敏劑對革蘭氏陰性菌的PDI效果[22]。如Hu Jiamiao等[23]發現EDTA可以促進對洋蔥伯克霍爾德菌的PDI作用。因此本實驗進一步分析EDTA作為協同劑對革蘭氏陰性菌——熒光假單胞菌PDI作用的促進效果。

如圖3所示，EDTA對PDI的協同增效作用隨著其質量分數的增加呈先增強后減弱的趨勢。與對照組相比，當EDTA質量分數分別為0.1%、0.3%時，熒光假單胞菌菌落數對數值分別顯著降低了0.37、0.91（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；當EDTA質量分數增加至0.5%時，PDI協同促進效果最佳，熒光假單胞菌菌落數對數值顯著下降2.29（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；之后隨著EDTA質量分數的增加，其對PDI的協同效果反而逐漸減弱。這很可能是由于EDTA質量分數過高，與姜黃素的稀釋劑-殼聚糖發生酸堿反應，間接影響姜黃素的結構，從而降低了其光敏性?？梢?，EDTA對姜黃素介導的PDI作用確實表現出對熒光假單胞菌的顯著的協同促進效果，很可能是通過破壞細菌細胞外膜的穩定性，增強了光敏劑向胞內的滲透。這對于后續優化EDTA的PDI協同劑量具有一定的參考價值。綜上，選擇0.5% EDTA溶液進行后續PDI處理。

圖3 EDTA質量分數對熒光假單胞菌菌落數的影響Fig. 3 Effect of EDTA concentration on total count of P. fluorescens

2.2 熒光假單胞菌生物膜的形成

了解生物膜的形成過程，有助于早期對食品表面及食品加工設備表面生物膜形成的不同階段進行干預，為生物膜的去除提供有價值的參考。采用結晶紫染色法觀察熒光假單胞菌在玻璃表面形成生物膜的過程。圖4A～H分別為培養0、6、12、24、36、48、60、72 h后的熒光假單胞菌生物膜經結晶紫染色后的顯微圖片。圖4A無生物膜形成；圖4B、C的熒光假單胞菌稀疏分散，隨著培養時間的延長，菌體分布逐漸密集；圖4D的菌體數量明顯增多，菌體之間相互聚集；培養至60 h時，生物膜已經相對成熟，菌體之間更加密集（圖4G）；培養至72 h，熒光假單胞菌已經將蓋玻片完全覆蓋（圖4H）?？梢?，熒光假單胞菌從開始的游離狀態到形成致密的生物膜是一個動態過程。綜上，選擇培養72 h后形成的熒光假單胞菌生物膜用于后續PDI處理效果研究。

圖4 熒光假單胞菌生物膜的形成Fig. 4 Formation process of P. fluorescens biofilm

2.3 姜黃素介導的PDI對熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

2.3.1 對玻璃表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

隨著冰箱、冷柜等冷藏設備的普及，冷藏和冷凍食品在日常飲食中所占比例逐漸增加。熒光假單胞菌為一種優勢嗜冷菌，常常黏附在冰箱、冷柜內部，逐漸形成生物膜，進而污染食品，導致食物發生腐敗[24]。本實驗采用冰箱、冷柜內部玻璃板作為載體，在其表面培養并形成熒光假單胞菌生物膜，研究姜黃素介導的PDI對其表面形成生物膜的破壞作用。姜黃素介導的PDI對玻璃表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果如表1所示。與空白組相比，光照條件下的姜黃素對熒光假單胞菌生物膜有顯著的破壞效果，菌落數對數值減小3.44（lg（CFU/mL）），加入EDTA后菌落數對數值減小4.57（lg（CFU/mL）），EDTA顯著提高了姜黃素的PDI作用（P＜0.05）。而無光照條件下的姜黃素對熒光假單胞菌生物膜的破壞作用有限，加入EDTA溶液后，滅活效果仍未得到改善。姜黃素處理浮游熒光假單胞菌的PDI作用可使菌落數對數值減小7.00（lg（CFU/mL））以上（2.1.1節結果），明顯優于對生物膜中細菌的PDI效果，這是由于細菌生物膜具有特殊的結構。致密的生物膜中包含大量的胞外多糖保護層，較浮游細菌具有更強的抵抗化學和熱滅活能力[25]。

表1 PDI處理對玻璃表面生物膜的破壞效果Table 1 Destructive effect of PDI on P. fluorescens biofilm formed on glass

2.3.2 對ABS板表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

實驗進一步采用冰箱、冷柜等內部材質ABS板作為載體，在其表面培養并形成熒光假單胞菌生物膜，研究姜黃素介導的PDI對其表面形成生物膜的破壞效果。由表2可知，姜黃素介導的PDI處理使其表面生物膜菌落數對數值下降4.42（lg（CFU/mL））；加入0.5% EDTA溶液后，菌落數對數值減小約6.60（lg（CFU/mL）），顯著提高了PDI效果（P＜0.05）。

表2 PDI處理對ABS板表面生物膜的破壞效果Table 2 Destructive effect of PDI treatment on biofilm formed on ABS plates

單一及混合生物膜的形成會加速食品的腐敗，引起食品安全問題，甚至造成食品加工設備的損壞。對食品表面、食品包裝材料表面及食品加工設備表面微生物生物膜的去除，是食品領域有待解決的一項難題。Cai Zhiyu等[26]研究報道，抗菌劑聯合PDI處理能顯著降低鈦表面金黃色葡萄球菌生物膜中的微生物數量。本課題組前期研究[27]報道了以姜黃素作為光敏劑的PDI處理可以有效滅活玻璃和不銹鋼表面金黃色葡萄球菌生物膜中的微生物。檀利軍等[28]也報道了姜黃素介導的光動力技術對副溶血性弧菌、腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除效果。可見，姜黃素及聯合EDTA等協同劑的PDI處理可為傳統殺菌技術提供有效的補充，為去除微生物生物膜提供一種新型、經濟有效的方法。

2.4 PDI處理對新鮮豬肉的保鮮效果

2.4.1 熒光假單胞菌菌落數變化

不同豬肉4 ℃貯藏期間熒光假單胞菌的菌落數變化如圖5所示。貯藏0 d，與空白組相比，PDI處理豬肉表面熒光假單胞菌菌落數對數值減小了2.68（lg（CFU/g）），添加0.5% EDTA后，豬肉表面菌落數對數值減少3.23（lg（CFU/g）），表明PDI處理對新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌具有良好的滅活效果，而且EDTA能夠進一步提高其滅活效果。隨貯藏時間的延長，空白組豬肉表面的熒光假單胞菌快速生長，第3天時菌落數增長至7.90（lg（CFU/g）），而經PDI處理后的豬肉中熒光假單胞菌生長緩慢，第3天時PDI組的菌落數為5.00（lg（CFU/g）），顯著低于空白組（P＜0.05）；第10天時，空白組豬肉的熒光假單胞菌菌落數增長至8.99（lg（CFU/g）），而PDI組的菌落數為6.57（lg（CFU/g）），PDI＋EDTA組豬肉中熒光假單胞菌菌落數僅為5.94（lg（CFU/g）），顯著低于其他處理組（P＜0.05），表明PDI＋EDTA處理對新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌具有更好的抑菌效果。

圖5 貯藏期間豬肉表面熒光假單胞菌菌落數的變化Fig. 5 Changes in P. fluorescens count on pork during storage

本課題組前期研制了姜黃素/殼聚糖/γ-聚谷氨酸可食性復合膜，并評價了該可食性膜對培根和火腿的光動力保鮮效果，該膜具備優良的物理特性和一定的機械強度，經PDI處理后對培根和火腿表面微生物起到顯著的抑制作用，且提升了產品的感官品質[29]。因此，在后續的研究中可以結合本次實驗的結果，進一步優化光動力殺菌條件，提高殺菌效果，同時開發更好的涂膜或包裝材料用于食品表面殺菌或保鮮。

2.4.2 質量損失率的變化

如圖6所示，在經過PDI處理后的當天，PDI組質量損失率最大，為2.14%；PDI＋EDTA組的質量損失率為1.79%。殼聚糖對照組及PDI組豬肉的質量損失率隨著貯藏時間的延長逐漸增大。豬肉經一定時間的光照處理后，表面溫度出現短暫、輕微的升高，這可能與豬肉質量損失有一定的關系。這也提示本實驗所用PDI處理設備需要增加冷卻裝置或提高光照強度以縮短光照時間?？傊?，解決光照引起的升溫及設備內部散熱差的問題，對于PDI技術及設備的應用是非常必要的。

圖6 貯藏期間豬肉的質量損失率Fig. 6 Mass loss percentage of pork during storage

2.4.3 色澤的變化

姜黃素是一種天然的黃色色素，由于其著色力強，具有一經著色就不易褪去等特點，在一定程度上限制了其在各個領域的廣泛應用[30]。而通過實驗發現，姜黃素經藍色LED燈照射一段時間后，其顏色變淺，這一發現有助于拓展姜黃素在食品殺菌領域的應用范圍。光照處理前后不同濃度的姜黃素溶液顏色如圖7A所示，光照20 min后，不同濃度的姜黃素溶液顏色均較光照前明顯變淺。王雪梅等[31]研究發現，乙醇溶液中的姜黃素在光照后會分解產生香草醛和阿魏酸，導致姜黃素溶液顏色變淺。

為了進一步探明不同濃度姜黃素在豬肉上的使用效果，采用色差儀分別測定不同濃度姜黃素PDI處理后豬肉的色澤，并計算ΔE，結果如圖7B所示，新鮮豬肉的ΔE與姜黃素濃度總體呈現正相關關系。75 μmol/L的姜黃素溶液處理豬肉經光照后，第0天ΔE為3.03，顯著高于對照組（P＜0.05），但感官上可以接受。姜黃素濃度越大，ΔE越大。同時，隨著新鮮豬肉貯藏時間的延長，ΔE沒有呈現出明顯的變化規律，且同一濃度姜黃素處理的豬肉無顯著性差異（P＞0.05）。

圖7 姜黃素溶液（A）和豬肉（B）色澤的變化Fig. 7 Color changes of curcumin solution (A) and changes in ΔE of pork (B)

2.4.4 pH值的變化

pH值是反映肉品質的重要指標之一。如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，各處理組豬肉的pH值逐漸升高，這主要是由于豬肉中細菌數量的增加其蛋白質和氨基酸發生降解，形成氨和胺類等堿性物質[32]。在10 d的貯藏期內，PDI＋EDTA組豬肉pH值從5.87增加至6.17，與空白組及其他處理組相比，pH值增加相對平緩。由此可以看出，PDI＋EDTA作用能夠減緩豬肉在貯藏過程中的腐敗速率，更好地保持豬肉的新鮮程度。

圖8 貯藏期間豬肉pH值的變化Fig. 8 Changes in pH of fresh pork during storage

3 結 論

本研究結合光敏劑姜黃素濃度、光照時間、協同劑EDTA，優化了對熒光假單胞菌PDI作用的最佳條件，明確了姜黃素協同EDTA的PDI作用對熒光假單胞菌生物膜的去除效果。應用實驗室自行研制的光動力殺菌裝置，嘗試分析EDTA聯合姜黃素的PDI作用對新鮮豬肉的保鮮效果。結果表明，姜黃素聯合EDTA的PDI作用對優勢嗜冷性腐敗菌-熒光假單胞菌及其生物膜均具有良好的滅活效果，并能顯著抑制新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌，改善豬肉感官品質，延長豬肉的保鮮期。

PDI作為一種新型的非熱殺菌技術在食品領域逐漸顯示出巨大的應用潛力。但該技術在實際應用中還存在一定的局限性，結合他人研究以及本實驗室開展的工作，認為后續研究可集中在以下方面進行：1）可以結合光動力協同劑、成膜劑等，研發可用于食品包裝、食品表面涂膜、加工設備殺菌的新型光動力殺菌材料，以提高殺菌效率和安全性；2）光動力殺菌設備的研發和優化，包括選擇合適的光源、光強度，并考慮溫度控制、對不同樣品的適應性等，以擴大光動力殺菌技術的應用范圍，實現可操作性；3）探討光動力殺菌與熱殺菌、化學殺菌等傳統殺菌技術的結合，嘗試將其運用在實際生產中，彌補傳統殺菌的缺陷和不足，以充分發揮光動力殺菌技術的優勢。