舒芬太尼對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲及Notch信號通路的影響▲

陳 思 王振宇 楊富國 彭紅軍 曹衛樂

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九九一醫院麻醉科，湖北省襄陽市 441000)

胃癌是起源于胃黏膜上皮常見的惡性腫瘤，是病死率較高的癌癥之一[1]。多種因素參與胃癌的發病機制，如吸煙、遺傳、地域和飲食結構等因素[2]。多數胃癌患者就診時病情已經處于中晚期，已錯過手術治療的時機，預后較差[3]。因此，尋找胃癌的保守治療方法至關重要。舒芬太尼是一種具有高選擇性的μ受體激動劑，屬于阿片類藥物，具有鎮痛效果明顯、起效快等特點，在臨床中常作為圍術期用藥及鎮痛藥物[4]。有研究結果顯示，阿片類藥物具有抑癌的作用[5]。例如，舒芬太尼能夠抑制胃癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期[6]。但是，舒芬太尼影響胃癌細胞遷移和侵襲的機制尚未明確。目前已有研究表明Notch信號通路與胃癌的發展密切相關[7]。另有學者發現，蘿卜硫素能夠通過激活Notch受體(Notch receptor 1,NOTCH)1/Hes家族BHLH轉錄因子(Hes family BHLH transcription factor，HES)1信號通路來抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖和促進細胞凋亡[8]。本研究主要分析舒芬太尼對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并基于Notch信號通路初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 胃癌AGS細胞購自中國科學院細胞庫；胎牛血清(批號：SH30084)、RPMI 1640培養基(批號：SH30027)購自美國HyClone公司；青霉素與鏈霉素雙抗(批號：15140)購自美國Gibco公司；舒芬太尼(批號：SH601879)購自湖北人福醫藥集團股份公司；MTT試劑盒(批號：GM01-500T)購自上海歌凡生物科技有限公司；凋亡檢測試劑盒(批號：KGA101)購自江蘇凱基生物公司；增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(批號：2586)、B細胞淋巴瘤2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(批號：15071)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(批號：89477)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2抗體(批號：40994)、NOTCH1抗體(批號：3608)和GAPDH抗體(批號：5174)購自美國CST公司；MMP14抗體(批號：ab51074)、HES5抗體(批號：ab194111)購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記二抗羊抗鼠IgG抗體(批號：ZB-2305)購自北京中杉金橋公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(批號：PC0020)、電化學發光液(批號：PE0010)、TBST(批號：T1085)購自北京索萊寶公司；Transwell小室(批號：3412)購自美國Corning公司；Matrigel基質膠(批號：356234)購自美國BD公司；Binding buffer(批號：200-070-505)購自上海恒斐生物科技有限公司；RIPA裂解液(批號：DXT-979006)購自上海科敏生物科技有限公司；脫脂奶粉(批號：A1789)購自北京康瑞納生物科技有限公司。

1.2 細胞培養和分組 從液氮罐內取出冷凍的胃癌AGS細胞，常規復蘇后置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min后除去上清液，接種在細胞培養板內，并放在37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，待細胞貼壁生長且融合度為75%～85%時，加入1 mL 0.25%胰酶消化并傳代培養。取生長狀態良好的胃癌細胞，接種至24孔板內(5×103個/mL)，然后選取含舒芬太尼(終濃度為0 nmol/L、5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L)的RPMI 1640培養基處理胃癌AGS細胞并培養48 h。

1.3 MTT檢測細胞活力 取胃癌細胞，接種在96孔細胞板內，每孔接種5×103個細胞，每孔200 μL，按1.2的方法進行分組和藥物干預，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。分別在培養24 h、48 h、72 h后取出細胞，加入20 μL的MTT試劑，繼續在培養箱中培養4 h，棄培養基后每孔加入150 μL的二甲基亞砜。應用Multiskan SkyHigh型酶標儀(賽默飛世爾科技公司)檢測各孔在570 nm處的吸光度值，用于計算細胞活力，細胞活力(%)=(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取上述1.2中干預后的各組胃癌細胞，采用PBS清洗2次，用1×Binding buffer重懸細胞，并將細胞密度調至1×106個/mL。按照凋亡試劑盒說明書，取100 μL的細胞懸液，先加10 μL的Annexin Ⅴ混勻，再加5 μL碘化丙啶染液充分混勻，避光反應15 min，在Attune NxT型流式細胞儀(賽默飛世爾科技公司)上檢測細胞的凋亡率。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP14、NOTCH1和HES5的蛋白表達 取上述1.2中干預后的各組胃癌細胞，采用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞的總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。在沸水中反應5 min后，將蛋白變性，取45 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉至PVEF膜，5%脫脂奶粉封閉膜2 h，分別加入一抗，分別為PCNA抗體(1 ∶500)、Bax抗體(1 ∶500)、Bcl-2抗體(1 ∶500)、MMP2抗體(1 ∶600)、MMP14抗體(1 ∶600)、NOTCH1抗體(1 ∶600)、HES5抗體(1 ∶600)和GAPDH抗體(1 ∶1 500)，4 ℃孵育過夜；使用TBST洗膜3次，5 min/次，加入HRP標記二抗羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000)，37 ℃下孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次。將電化學發光液(比例1 ∶1)加入膜內顯影。以GAPDH作為內參，采用凝膠成像系統及Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

1.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力 (1)細胞遷移實驗：取上述1.2中干預后的各組胃癌細胞，并采用不含血清的培養基調整細胞密度為5×105個/mL，在孔徑為8.0 μm的Transwell小室的上室內加入100 μL不含血清的細胞懸液，下室添加500 μL含有10%血清的RPMI 1640培養液，培養24 h后，取出Transwell小室擦掉未穿過膜的細胞，采用4%多聚甲醛固定細胞20 min后采用1%結晶紫染色細胞10 min。選取視野明亮的區域置于顯微鏡下觀察細胞遷移數目。(2)細胞侵襲實驗：在進行實驗前，將Matrigel基質膠按3 ∶1比例稀釋，取100 μL的稀釋Matrigel基質膠加入Transwell小室的上室內，在培養箱內孵育5 h，其余實驗步驟與遷移實驗一致。實驗重復3次。

1.7 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度的舒芬太尼對胃癌細胞增殖和凋亡的影響 與未使用舒芬太尼(0 nmol/L)作用相比，不同濃度的舒芬太尼(5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L)作用后，胃癌細胞活力、PCNA和Bcl-2蛋白表達水平降低，細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平增加(均P<0.05)；隨著舒芬太尼濃度的增加，胃癌細胞活力、PCNA和Bcl-2蛋白表達逐漸降低，細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平逐漸增加(均P<0.05)。見表1和圖1。

表1 不同濃度舒芬太尼作用下胃癌細胞活力、凋亡率及相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.2 不同濃度的舒芬太尼對胃癌細胞遷移和侵襲的影響 與未使用舒芬太尼(0 nmol/L)作用相比，50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼作用后遷移細胞數目、侵襲細胞數目減少，且5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L舒芬太尼干預后遷移細胞數目、侵襲細胞數目依次減少(均P<0.05)；5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼作用后胃癌細胞的MMP2和MMP14蛋白表達水平均降低，且隨著舒芬太尼濃度的增加，MMP2和MMP14蛋白表達水平逐漸降低(均P<0.05)。見表2和圖2。

表2 不同濃度舒芬太尼作用下胃癌細胞的遷移、侵襲情況及相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.3 不同濃度的舒芬太尼對胃癌細胞Notch信號通路相關蛋白表達的影響 與未使用舒芬太尼(0 nmol/L)作用相比，不同濃度的舒芬太尼(5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L)作用后，胃癌細胞的NOTCH1和HES5蛋白表達水平均降低(均P<0.05)；隨著舒芬太尼濃度的增加，胃癌細胞的NOTCH1和HES5蛋白表達水平逐漸降低(均P<0.05)。見表3和圖3。

表3 不同濃度舒芬太尼作用后胃癌細胞Notch信號通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

2020年，胃癌的新發病例數在全球癌癥中位居第五，死亡病例數在全球排名第四[9]。在我國，胃癌的發病率和病死率較高，嚴重影響患者的生活質量和生命。舒芬太尼是苯哌啶衍生物，為強效麻醉鎮痛藥，其結構和作用與芬太尼相似，具有鎮痛效果強、毒性較低的優點，被廣泛應用于晚期癌癥患者的手術麻醉和術后鎮痛[10-11]。舒芬太尼在多種腫瘤中起到抑癌的作用：舒芬太尼能夠通過調控miR-495/Wnt/β-catenin軸抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并阻滯細胞周期，誘導細胞的凋亡[12-13]；舒芬太尼能夠抑制肺腺癌細胞的增殖及誘導細胞的凋亡，上調p53、Bax蛋白的表達，下調Bcl-2蛋白表達[14]；舒芬太尼能夠使細胞周期停滯，抑制胃癌細胞的增殖和促進細胞的凋亡[15]。本研究采用濃度為0 nmol/L、5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼處理胃癌AGS細胞，結果顯示，舒芬太尼可以明顯地抑制細胞的活力、遷移和侵襲能力，促進細胞的凋亡，下調增殖相關蛋白PCNA、抗凋亡蛋白Bcl-2、侵襲相關蛋白MMP2和MMP14的表達，上調促凋亡蛋白Bax的表達，且上述作用呈濃度依賴性(均P<0.05)。這說明舒芬太尼在胃癌細胞中具有抑癌的作用。

Notch信號通路是一種高度保守的細胞信號通路，參與多種癌癥中的生物學效應，如細胞增殖、凋亡、周期、遷移和侵襲等，在癌癥發生和發展中具有重要的作用[16]。目前Notch信號通路中已經明確的配體有5個(包括DLL-1、DLL-3、DLL-4、Jag-1和Jag-2)，與其相應的受體有4個，主要包括NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4，當配體與受體結合后，可以啟動下游Hes和Hey基因的轉錄進而發揮其在癌癥中的作用[17-18]。有研究結果顯示，在胃癌組織中NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4和Jag-2表達水平上調，其中胃癌組織中NOTCH1蛋白的表達明顯高于癌旁組織[19]。沉默環氧化酶2可通過抑制Notch信號通路來抑制胃癌細胞的增殖和誘導細胞的凋亡[20]。趙恩昊等[21]的研究結果顯示，NOTCH1 mRNA和蛋白在胃癌細胞中高表達，利用RNA干擾技術沉默NOTCH1可以抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究采用濃度為5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的舒芬太尼處理胃癌AGS細胞后，胃癌細胞中NOTCH1和HES5蛋白表達下調，呈濃度依賴性降低(均P<0.05)，說明舒芬太尼可能通過調控Notch信號通路的表達發揮抗胃癌的作用。

綜上所述，舒芬太尼能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，其作用機制可能與抑制NOTCH1信號通路有關，這或可為胃癌的研究提供新的思路和方向。今后，可通過開展過表達NOTCH1實驗及體內實驗進一步驗證舒芬太尼抗胃癌的作用機制。