BMSCs對潰瘍性結腸炎合并肝損傷小鼠的肝臟修復作用及對緊密連接蛋白表達的影響▲

彭家茵 鄧哲君 孟云超 羅文捷 趙 磊 張啟芳

(1 桂林醫學院研究生學院，廣西桂林市 541004； 2 廣西醫科大學研究生學院，廣西南寧市 530021；廣西壯族自治區南溪山醫院3 消化內科，4 病理科，廣西桂林市 541002)

肝臟緊密連接是由蛋白復合物組成的連續屏障結構，其將細胞膜分為基底側和頂端側，可限制胞膜內的蛋白運動，并能維持細胞極性。此外，緊密連接可調節細胞間通透性，限制水和溶質自由通過細胞旁間隙，同時阻止細菌產物、病原體及過敏原等進入組織[1]。肝臟中的緊密連接沿著膽管或肝細胞間分布，以封閉細胞旁間隙，使膽汁在膽管中流動[2]。潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)患者常合并肝損傷[3]。實驗表明，葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)不僅可誘導大鼠出現結腸炎，而且還可使得其肝組織中的緊密連接蛋白表達發生改變[4-5]。卞晶晶等[6]研究發現，經靜脈移植的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可遷移至急性肝損傷小鼠模型的肝組織內，減少肝組織炎癥細胞浸潤，改善肝臟組織結構排列。因此，本研究探討BMSCs對UC合并肝損傷小鼠的肝臟修復作用及對肝臟緊密連接蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 取15只無特定病原體級6～7周齡Balb/c雌性小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCK20070005)用于實驗，體質量19～21 g，將其飼養于清潔級實驗室，室內溫度(20±4)℃，濕度45%～60%，通風良好，光照隨晝夜浮動。另取4只無特定病原體級3周齡Balb/c雄性小鼠用于分離提取BMSCs，體質量9～11 g，來源及喂養要求同上。

1.2 主要實驗試劑和儀器 4% DSS購自美國Sigma公司(批號：31404)，低糖DMEM購自美國Gibco公司(批號：31600034)，12%中性甲醛固定液購自北京雷根生物技術有限公司(批號：DF0113)，TRIzol試劑購自天根生化科技(北京)有限公司(批號：DP424)，反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑購自立陶宛Fermentas公司(批號：K1622)。目的基因claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7、封閉蛋白(occludin)、閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens 1,ZO-1)及內參基因α-actin的引物均由上海銳賽生物科技(集團)有限公司設計合成，引物序列見表1。Chemray240全自動生化分析儀購自美國Rayto公司，BX51光學顯微鏡購自日本Olympus公司，ML4002精密天平購自德國梅特勒-托利多公司，UV2401PC紫外分光光度計購自日本島津公司，7500實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

表1 引物序列

1.3 BMSCs的分離培養與鑒定 按照相關文獻[7]中的方法進行BMSCs分離與培養，主要步驟為：頸離斷處死3周齡Balb/c雄性小鼠，分離股骨，使用注射器抽吸低糖DMEM沖洗骨髓腔，沖洗液中的細胞經重懸后接種于無菌塑料培養瓶中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中培養，培養液為含10%胎牛血清的DMEM，培養24 h細胞貼壁后首次更換培養液，此后每2～3 d更換一次培養液。取形態均一、活性良好的第3～4代細胞進行鑒定，然后用于后續實驗。根據國際細胞治療協會2006年制訂的多功能間充質干細胞的基本定義[8]對培養細胞進行鑒定：(1)貼壁生長；(2)細胞表面表達特異性抗原，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29、CD45、CD90的表達情況；(3)驗證干細胞多向分化潛能，包括采用Von Kossa染色法評估抗壞血酸/甘油磷酸鈉培養3周后BMSCs的成骨情況，以及油紅O染色法評估經地塞米松誘導后BMSCs的成脂情況。

1.4 分組、建模和干預方法 將15只6～7周齡Balb/c雌性小鼠按隨機數字表法分為陰性對照組、實驗對照組及實驗組，每組5只。陰性對照組小鼠正常飲水，其余兩組小鼠每天自由飲用4% DSS水溶液，連續3周。造模期間，每天觀察小鼠的精神狀態、進食、飲水及活動等一般情況，每天定時稱體重1次，記錄小鼠糞便情況[7]。造模結束后第8天，給予陰性對照組和實驗對照組小鼠經尾靜脈注射PBS 0.3 mL，給予實驗組小鼠經尾靜脈注射0.3 mL的BMSCs懸液(含1×106細胞)進行干預1次。

1.5 標本的收集與處理 于BMSCs移植干預后第9天，摘除各組小鼠一側眼球后取血0.7～1.0 mL，立即將血標本在4 ℃下以3 000 r/min離心5 min，取血清行肝功能指標檢測。取血后采用頸椎脫臼法處死所有小鼠，打開腹腔，取出結腸組織和肝臟組織。將肝臟組織呈冠狀位切開分為A、B兩部分，將A部分置于12%中性甲醛中固定24 h后制作病理切片，將B部分放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于實時熒光定量PCR檢測。取結腸病變組織(陰性對照組則取相應部位的結腸組織)置于12%中性甲醛中固定24 h后制作病理切片。進行相應檢測前須確認血清標本無溶血、冰凍肝組織無損毀、標簽無脫落及標記清晰等情況。

1.6 測定肝功能 采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清ALT、AST、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和總膽紅素水平。

1.7 制備組織切片及組織病理學觀察 取固定后的結腸和肝臟組織，由廣西壯族自治區南溪山醫院病理專科技師進行脫水、透明、石蠟包埋，使用輪式切片機制作5 μm切片，貼片后烘片，進行HE染色。制作好的玻片由2名廣西壯族自治區南溪山醫院病理專科醫師在顯微鏡下觀察并拍照采圖。

1.8 實時熒光定量PCR檢測肝臟組織中緊密連接蛋白的mRNA表達水平 取約100 mg肝臟組織標本置于干凈預冷的研缽中，倒入適量液氮，在全自動研磨儀中將肝臟組織標本研磨成粉末，按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA純度后，將其反轉錄成cDNA，使用實時熒光定量PCR儀進行PCR反應，每個標本重復上樣3次。PCR總體系為20 μL，包括2×SYBR Green Mix 10 μL、引物Mix 1 μL、cDNA模板5 μL、超純水4 μL。 PCR程序： 95.0 ℃預變性5 min；95.0 ℃ 變性10 s，60.0 ℃退火30 s， 72.0 ℃延伸30 s，40個循環。以α-actin為內參，采用2-ΔΔCt法進行半定量分析，計算目的基因的mRNA相對表達水平。

1.9 統計學分析 使用SPSS 25軟件進行統計學分析。計量資料均以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs的鑒定情況 流式細胞檢測結果提示CD29(+)、CD45(-)、CD90(+)，Von Kossa染色及油紅O染色結果提示成功誘導BMSCs分化為成骨細胞、脂肪細胞，說明成功分離BMSCs。

2.2 3組小鼠造模期間一般情況及結腸組織病理變化 在造模期間，陰性對照組小鼠一般情況良好，大便成型；實驗對照組小鼠皮毛缺乏光澤，體重下降，反應遲鈍，活動減少，大便呈糊狀或水狀，逐漸出現血便或便血。實驗組小鼠毛色光澤度差于陰性對照組小鼠，小鼠活動度基本正常，部分小鼠出現輕度體重減輕或便中帶血，但癥狀輕于實驗對照組小鼠。陰性對照組小鼠結腸上皮細胞、腺體排列規則，隱窩形態正常，未見炎癥細胞浸潤；實驗對照組小鼠結腸黏膜上皮結構破壞明顯，腺體及隱窩結構破壞，可見大量炎癥細胞浸潤黏膜固有層及黏膜下層；實驗組小鼠結腸黏膜上皮結構尚規整，黏膜固有層腺體、隱窩基本正常，可見少量炎癥細胞浸潤黏膜固有層，程度明顯輕于實驗對照組。

2.3 3組小鼠血清肝功能指標的比較 實驗對照組小鼠的血清ALT、AST、ALP及總膽紅素水平均高于陰性對照組(均P<0.05)；實驗組小鼠的血清ALT、AST、總膽紅素水平均低于實驗對照組(均P<0.05)，而實驗組小鼠的血清ALP水平較實驗對照組有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組小鼠血清肝功能指標的比較(x±s)

2.4 3組小鼠肝臟組織病理學的改變情況 陰性對照組小鼠肝臟結構大致正常。實驗對照組肝小葉結構不完整，肝索結構不清，肝竇變窄，小葉間靜脈及中央靜脈呈瘀血樣改變，可見炎癥細胞浸潤及少量肝細胞壞死。實驗組小鼠肝小葉結構基本完整，肝索放射狀排列欠規則，肝竇間隙較實驗對照組小鼠增寬，小葉間靜脈瘀血較實驗對照組小鼠減輕，肝細胞未見壞死，僅見少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.5 3組小鼠肝臟組織中緊密連接蛋白mRNA表達水平的比較 實驗對照組小鼠肝臟組織的claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表達水平均低于陰性對照組(均P<0.05)；實驗組小鼠肝臟組織的claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表達水平均高于實驗對照組，而claudin-2 mRNA表達水平低于實驗對照組(均P<0.05)。3組小鼠肝臟組織的occludin mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組小鼠肝臟組織中緊密連接蛋白mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

緊密連接封閉膽管并保證膽汁在膽管腔內，構成血液-膽汁屏障；當緊密連接結構被破壞，膽汁返流入肝血竇，機體出現膽汁淤積。緊密連接蛋白在多種肝臟疾病中的表達均發生改變[9-11]。claudin是緊密連接蛋白的關鍵成分，目前發現了其至少有27個成員，主要功能包括調節細胞外通透性、細胞極性、細胞分化和增殖、細胞遷移和凋亡，以及介導細胞信號傳導等[12]。其中，claudin-1基因的功能障礙會導致膽汁滲漏、肝內膽汁淤積和肝細胞損傷，引起新生兒硬化性膽管炎伴魚鱗病[13]。此外，claudin-1在丙型肝炎病毒入侵肝細胞的過程中發揮著重要作用[14]。敲除claudin-2基因后膽汁中的Na+濃度降低，膽汁酸和脂質成分濃縮，膽汁流速降低，從而促進膽固醇結石的形成[15]。敲除claudin-3基因可導致旁細胞屏障功能降低，增加Ca2+、PO43-經肝膽管上皮的旁細胞轉運，促進膽固醇結石形成[16]。occludin不僅起封閉細胞旁間隙作用，在信號通路的傳導中也起重要作用。occludin高表達可使得緊密連接蛋白數量及上皮細胞跨膜電阻增加[17]。Miura等[18]的研究表明，claudin-3和occludin等蛋白的低表達水平可使得膽小管的結構破壞甚至消失。Zeisel等[19]研究發現，occludin在丙型肝炎病毒入侵肝細胞的過程中起重要作用。ZO-1屬于膜連接鳥苷酸激酶蛋白家族，參與調節細胞內物質的轉運，維持上皮極性，在細胞的增殖分化中發揮作用[20]。ZO-1的N端有與occludin等蛋白結合的區域，而C端可結合肌動蛋白，在其他緊密連接蛋白與肌動蛋白間起橋梁作用[21]。

本研究利用DSS構建UC模型，實驗對照組小鼠在建模過程中體重下降，反應遲鈍，活動減少，大便呈糊狀或水狀，逐漸出現血便或便血，結腸組織病理檢查提示結腸黏膜上皮結構破壞明顯，腺體及隱窩結構破壞，可見大量炎癥細胞浸潤黏膜固有層及黏膜下層，這提示成功建立UC模型；實驗對照組小鼠的ALT、AST、ALP及總膽紅素水平均高于陰性對照組(均P<0.05)，肝臟組織發生肝小葉結構紊亂、炎癥細胞浸潤等改變，這提示成功建立UC合并肝損傷小鼠模型。實驗對照組小鼠肝臟組織中的claudin-1、claudin-2、claudin-3、claudin-7及ZO-1的mRNA表達水平均低于陰性對照組(P<0.05)，這提示UC可合并肝臟緊密連接受損。而注射BMSCs后，實驗組小鼠的UC癥狀及結腸病理表現均有所減輕，肝功能及肝臟病理損傷均改善，且肝臟組織中的claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1 mRNA表達水平均高于實驗對照組小鼠(均P<0.05)，這表明BMSCs對UC合并肝損傷小鼠模型的結腸及肝臟均具有修復作用，并可提高肝臟緊密連接蛋白mRNA的表達水平。研究表明，BMSCs經尾靜脈注射進入血液循環后，可在損傷局部微環境及外周血的趨化作用下遷移至損傷部位，抑制腫瘤壞死因子α和白細胞介素等炎癥因子的表達，并分泌肝細胞生長因子[22]，而腫瘤壞死因子α可抑制claudin-1、occludin和ZO-1表達[23-24]，肝細胞生長因子可刺激claudin-7通過細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制細胞遷移和侵襲[25]。可見BMSCs可能通過抑制腫瘤壞死因子α及分泌肝細胞生長因子等來增強claudin-1、claudin-3、claudin-7及ZO-1的表達，從而實現對肝臟的修復作用。此外，本實驗中的BMSCs還可能通過修復腸黏膜損傷，減少腸源毒素損傷肝臟。既往研究表明，間充質干細胞對結腸炎有治療作用[26-28]，結合本研究結果，BMSCs或可成為治療UC合并肝損傷的一種新方法。本研究結果還顯示，實驗對照組小鼠肝臟組織中claudin-2、occludin的mRNA表達水平有所下降，但在注射BMSCs后claudin-2、occludin的表達水平未見明顯改善，這可能與機體的修復功能有關，其機制仍需進一步研究。

綜上所述，BMSCs對UC合并肝損傷小鼠模型的肝臟有一定的修復作用，并可提高肝臟緊密連接蛋白mRNA的表達水平，其可能通過影響緊密連接蛋白的表達實現對肝臟的修復作用。