180例不明原因智力障礙兒童的脆性X綜合征檢出情況▲

鐘青燕 熊小波 曾 婷 王大永 吳勇聰 袁德健 蔡 稔 嚴提珍

[1 柳州市婦幼保健院醫學遺傳科，廣西柳州市 545001； 2 柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室，廣西柳州市 545001； 3 柳州市婦幼保健院兒童保健科，廣西柳州市 545001； 4 蘇州新波生物技術有限公司，江蘇省蘇州市 201203； 5 珀金埃爾默醫學診斷產品(上海)有限公司，上海市 215400]

智力障礙包括一系列以低智商、適應性行為和功能受限為特征的癥狀[1-2]。在全世界人群中智力障礙的患病率約為1%，嚴重智力障礙的患病率約為0.6%[3]。遺傳因素是智力障礙發生的主要影響因素，由這一因素導致的智力障礙患者占85%[4]。其中，脆性X綜合征(fragile X syndrome,FXS)是智力障礙常見的遺傳因素。FXS的主要臨床表現為不同程度的智力低下、孤獨癥、特殊面容(長臉、大耳朵、尖下巴)、男性巨睪等。FXS發病的主要分子機制是脆性X智力低下1( fragile X mental retardation 1,FMR1)基因5′端非編碼區的三核苷酸重復序列CGG過度擴增[5]。既往關于FMR1基因的缺失和點突變的研究顯示[6-7]，FMR1基因位于X染色體q27.3,全長38 kb，由17個外顯子和16個內含子組成，編碼FMR1蛋白，在其上游約250 bp處有一個CpG島。美國人類遺傳學學會指南[8]根據FMR1基因CGG序列的重復次數將其基因型劃分為正常型、中間型(灰區)、前突變型和全突變型。其中，重復次數6～44次為正常型，FMR1基因可以正常表達，無臨床表現；重復次數45～54次為中間型，無明顯臨床表現，子代可擴增為前突變型；重復次數55～200次為前突變型，約有20%攜帶前突變型FMR1基因的女性會發生卵巢功能不全或卵巢早衰，攜帶前突變型FMR1基因的部分男性和少部分女性由于X染色體失活，在成人期會出現脆性X相關性震顫/共濟失調綜合征；重復次數大于200次為全突變型，在男性FMR1基因發生全突變會導致CpG島異常甲基化，抑制FMR1基因正常表達，導致FMR1嚴重減少或缺乏，表現為典型的FXS，也有 30%～50%攜帶全突變型FMR1基因的女性表現輕重程度不等的智力低下。由于FXS的臨床表現復雜多樣，且青春期之前的兒童臨床表現不明顯，因此需要借助基因診斷的方法對患兒進行早期診斷、早期干預。本研究運用PCR微流控毛細管電泳技術聯合Southern印跡雜交法對FMR1基因進行CGG重復次數檢測， 分析不明原因智力障礙兒童FXS的發病率，以期為本地區智力低下人群的FXS發生率研究提供參考數據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2017年12月到2020年5月期間在柳州市婦幼保健院就診的所有不明原因智力障礙兒童(180例)及部分FMR1基因突變患兒的家系成員(2個家系共5例)。180例兒童中男童145例、女童35例，年齡為1.39～11.92(3.81±1.77)歲。智力障礙的診斷標準：智力水平落后于同齡人平均智商兩個標準差以上，即智商≤70分；存在適應性行為缺陷。本研究經柳州市婦幼保健院審查倫理委員會審批通過(20160227042)，研究對象和/或其監護人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA樣本準備：使用核酸提取試劑盒(蘇州新波生物技術有限公司，批號：AQ20201001)，在Chemagic 360全自動核酸提取儀(蘇州新波生物技術有限公司)上提取受試者外周血(200 μL)基因組DNA，提取的基因組DNA用于PCR檢測。另使用QIAamp DSP全血DNA提取試劑盒(Qiagen公司，批號：166016522)提取基因組DNA，用于Southern印跡雜交。所有實驗步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.2 PCR微流控毛細管電泳技術：使用FMR1基因檢測試劑盒(PCR微流控芯片毛細管電泳法，蘇州新波生物技術有限公司，批號：AR20200901)進行FMR1基因突變分析。對受試者基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系共20 μL，包括FX反應液15 μL、FX稀釋液3.8 μL、FX聚合酶0.2 μL、DNA模板1 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min；98 ℃變性35 s，61 ℃退火35 s，72 ℃延伸4 min，共25個循環；72 ℃終延伸10 min。將獲得的PCR產物進行核酸純化，純化后的PCR產物在LabChip GX Touch微流控毛細管電泳儀(蘇州新波生物技術有限公司，型號：LabChip GX Touch)上進行PCR產物片段大小分析。本研究同時采用已知重復次數的參考樣本(質控DNA，5個不同CGG重復次數的DNA片段，29/43/56/100/375 CGG重復次數)構建標準曲線，測定樣本通過標準曲線換算得到更高精度的CGG重復數。

1.2.3 Southern印跡雜交法：將所有FMR1基因全突變型病例樣本送到中南大學生命科學學院遺傳研究中心進行Southern印跡雜交檢測。

2 結 果

2.1 PCR微流控毛細管電泳技術檢測結果 180例患兒中，檢出FMR1基因全突變型4例(均為男童)、中間型1例、正常型175例，FXS檢出率為2.22%(4/180)；正常型的CGG重復次數范圍是12～44次，最常見的CGG重復次數是28次和29次。4例FMR1基因全突變型的家系中，家系1先證者CGG重復次數為190/248/370次，母親為25次和134次，妹妹為39次和148/218/554次，姨媽為29次和29次；家系2先證者CGG重復次數為859次(此家系僅檢測了患者)；家系3先證者CGG重復次數為529次，母親為31次和76次，姐姐為29次和130次；家系4先證者CGG重復次數為525次(此家系僅檢測了患者)。4例FMR1基因全突變型病例家系的臨床表現及基因檢測結果見表1，家系1的PCR微流控毛細管電泳檢測結果圖譜見圖1。

2.2 Southern印跡雜交法檢測結果 FMR1基因全突變型病例的樣本經Southern印跡雜交檢測驗證，結果都顯示有>5.8 kb條帶(全突變條帶)，與PCR微流控毛細管電泳檢測基因分型結果完全一致，見表1。

表1 4例全突變型患兒及家系的臨床表現和檢測結果

3 討 論

1977年Sutherland[9]最早采用G顯帶技術發現并證明了X染色體q27.3上存在脆性位點。該方法操作煩瑣、費時、可靠性差，已逐漸被替代。1991 年Verkerk 等[10]應用定位克隆法在X染色體q27.3附近發現了FMR1基因，使FXS的診斷進入分子水平階段。目前Southern印跡雜交法是FXS基因診斷的金標準，但該方法所需樣本量大、檢測通量低、操作復雜、耗時長、成本高，因而不適合用于常規篩查。最初的PCR只能檢測正常和小片段前突變等位基因，對于大片段前突變型和全突變型基因，由于GC含量增高容易導致極高的Tm值，以及CGG重復次數增多容易形成穩定的二級結構，而不能很好地完成擴增。隨著人們對FXS相關基因不斷地了解和認識，PCR技術得到了不斷的優化，這一難題逐步得到解決。本研究引用PerkinElmer專利技術，用一對跨越FMR1基因啟動子5′非編碼區CGG重復序列的特異性引物進行PCR擴增，獲得包含全部CGG重復序列的PCR產物，PCR產物經過核酸純化試劑盒的純化后，使用全自動微流控芯片毛細管電泳儀通用試劑盒，在全自動微流控芯片毛細管電泳分析儀上分析DNA片段的大小，同時根據標準曲線計算出CGG重復次數，能實現對FMR1基因5′非編碼區CGG重復序列的精確定量，從而準確區分正常型、中間型、前突變型、全突變型，可有效識別CGG重復次數高達1 400次的全突變型，整個過程僅需6 h，高效快速，方法簡便易操作，適用于大規模人群篩查。本研究中，4例FMR1基因全突變型病例的樣本經Southern印跡雜交法驗證，均顯示有>5.8 kb條帶(全突變條帶)，提示兩種檢測結果一致，表明PCR微流控毛細管電泳技術能有效檢出FMR1基因全突變型。

本研究采用PCR微流控毛細管電泳技術對180例不明原因智力障礙兒童進行FMR1基因突變分析，結果顯示正常型CGG重復次數范圍為12～44次，最常見的等位基因重復次數是28次和29次，與Chen等[11]報告的結果相似。本研究中，180例不明原因智力障礙兒童的FXS檢出率為2.22%，與Zhong等[12]在中國東、西、南、北、中部地區5個城市的1 127例智力低下患者中的FXS檢出率(2.8%)相近。不同國家或地區報告的智力低下人群的FXS發生率差異較大：歐美發達地區的發生率一般在1%～4%之間[13-14]，巴基斯坦發生率為4.8%[15]；而在我國，葉志純等[16]報告湖南省先天性智力低下兒童的FXS發生率高達8.05%，羅詩坤等[17]報告華南和華中等地區不明原因智力障礙患者的FXS發生率高達9.4%。產生這些差異的主要原因，筆者認為有以下幾點：(1)雖然FXS影響全球所有種族，但由于種族差異，不同人群的患病率可能有所不同。(2)根據上述研究結果可以看出，發達國家智力低下人群的FXS發生率總體上低于發展中國家，可能原因是發達國家較早開展此方面的研究，比較重視智力障礙人群的遺傳史和家族史，較早制定相應的指南規范，使得FXS得到較好的預防和控制，因此發生率相對更低。(3)各研究所納入的人群不一樣，FXS發生率差異比較大。本研究和Zhong等[12]納入的人群均為不明原因智力障礙的兒童，而葉志純等[16]納入的人群為臨床上高度懷疑為FXS的患者，且發育商在0～55分之間，羅詩坤等[17]納入的人群是已經排除了染色體病、基因組病和遺傳性代謝病的不明原因智力障礙患者，這大大縮小了納入人群范圍，故與本研究的發生率相差比較大。

總之，在不明原因智力障礙兒童中存在一定比例的FXS患兒。目前尚無有效治療FXS的方法，用葉酸輔以營養神經和神經康復治療可改善FXS患者的智力狀況，年幼者效果更好。臨床上應對疑似FXS的患兒進行基因診斷，盡早明確診斷后可以早期給予藥物、行為、言語、心理等干預，從而提高患兒的生活自理能力，改善患兒的生活質量，減輕社會負擔。同時，應對患兒家族成員進行基因診斷，為其提供遺傳咨詢和生育指導，避免此類患兒的出生。