基于PCR和LFS技術的摻假豌豆成分快速檢測

王 凱, 屈 瑋, 姚幫本,2, 徐建國, 姚 麗

(1.合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601;2.安徽省產品質量監督檢驗研究院,安徽 合肥 230051)

目前摻假問題已成為包括加工、流通和餐飲在內的整個食品供應鏈中的質量問題。摻假通常是指在高價原料中摻入配料或替代較便宜的配料,以賺取更多利潤和/或在食品制造、加工、包裝或儲存過程中不遵守衛生規則[1]。市面上已經出現各種摻假行為,包括油、蜂蜜、乳制品、果汁、咖啡、面粉和肉類產品等摻假[2-4]。近年來,也出現各種豆類摻假現象,以綠豆食品為例,一些企業為獲取高額利潤,常利用豌豆、大豆等其他原材料充當綠豆食品出售[5-6],特別在綠豆糕中,有些綠豆糕中豌豆占主要成分。這些對消費市場產生了負面影響,損害了國民經濟,在某些情況下對特殊人群(如過敏反應者)產生健康威脅。為了防止此類食品欺詐事件的發生,需要開發一種可靠且靈敏的分析工具,以便對豆類品種進行鑒定。

針對摻假檢測,研究人員基于蛋白質和DNA分析技術開發了許多摻假材料定性和定量分析方法?；诘鞍踪|的檢測方法,包括高效液相色譜、電泳技術和酶聯免疫吸附測定等[7-8],在物種鑒定中顯示出令人滿意的結果。但該方法取決于多肽靶標的檢測,該靶標始終是組織依賴性的[9],當經過熱處理時,它們較低的靈敏度缺點就會顯現,并且這些檢測方法大多需要昂貴儀器、危險有毒樣品制備以及熟練的人員,相對來說難以準確、方便且廉價地進行摻假的檢測。與基于蛋白質檢測方法相比,基于DNA的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)被認為是一種更可靠穩定的方法。首先,DNA可以承受高溫引起的降解,因此,足夠長且完整的片段仍可用于擴增[10];其次,PCR擴增以高靈敏度和特異性為特征,可以通過非常少量的DNA分析就能檢測出低含量的豌豆摻假。此外,基因組DNA可以從任何植物組織中提取,并且不受環境條件或植物發育階段的影響[11]。但在所有PCR方法中,用于物種鑒定的直接PCR分析都需要凝膠電泳相配合[12],電泳檢測步驟相對繁瑣,檢測時間長,并且會接觸有毒甚至致癌藥物。然而,用于常規驗證檢測和現場檢測的側向流試紙條(lateral flow strip,LFS)技術成為PCR后電泳檢測良好的替代方法。對于PCR-LFS檢測,首先需要在5’端標記基因特異性引物(例如,通過生物素和熒光素修飾),然后用于擴增,最后使用試紙條檢測標記PCR產物[13]。由于LFS技術易于使用,反應迅速且價格合理,同時該技術無需經過培訓的操作人員和配備精良的實驗室即可對待檢成分進行適當的檢測,使其被越來越廣泛地使用。此外,由于其響應時間短(5～10 min),并且可以進行原位測試,因此可以在短時間內采取糾正措施。

本文采用PCR和LFS相結合方法,對綠豆食品中的摻假豌豆成分進行快速檢測。實驗采用穩定和高效的PCR技術,擴增出生物素(Biotin)和異硫氰酸熒光素(FITC)雙標記的特異性的豌豆基因產物,然后用識別目標分析物的LFS技術進行檢測,可以在2 h內快速、方便地對摻假豌豆成分進行可視化鑒別,該方法僅依靠肉眼觀察或便攜式設備就可以進行圖像的檢測和分析。

1 材料方法

1.1 實驗樣本

實驗所需的豌豆、綠豆、黑豆、紅豆、蠶豆和蕓豆等均在超市購買。摻假樣本的制備是先將綠豆和豌豆磨成粉,然后將豌豆粉末按照質量分數100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的比例摻入綠豆粉中作為摻假樣本。

1.2 實驗試劑

三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、乙二胺四乙酸、硼酸、氯化鈉、氫氧化鈉、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、彩色乳膠微球和其他實驗中所用的化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司;鏈霉親和素(SAV)、牛血清蛋白(BSA)、dNTP混合液、蛋白酶K,核糖核酸酶、DNA Marker,4S Red plus核酸染料、瓊脂糖粉末、TBE粉末等均購于生工生物工程(上海)股份有限公司;FITC抗體、二抗均購于廣州格瑞林生物科技有限公司;結合墊、樣品墊、聚氯乙烯(PVC)結合墊、吸收墊和硝酸纖維素(NC)膜均購于潔寧生物技術公司;實驗所需FITC和Biotin功能化修飾上下游引物由通用生物系統有限公司合成。

1.3 實驗儀器

實驗所用儀器有粉碎機、分析天平、水浴鍋、PCR儀、電泳儀、核酸測定儀、凝膠成像系統、高速冷凍離心機、純水儀、恒溫干燥箱、pH計、噴膜機和全自動切條機等。

1.4 DNA提取

本實驗采用磁珠法提取DNA,該方法參考文獻[14]方法并稍做修改。將豌豆用粉碎機磨成粉,稱取50 mg豌豆粉加入1.5 mL 離心管管中,然后加入700 μL SDS緩沖液,30 μL蛋白酶和5 μL核糖核苷酸酶,在65 ℃水浴鍋中加熱1 h。水浴完成后,冷卻至室溫,12 000 r/min離心1 min,取上清加入新的離心管,加入1/10體積分數醋酸鉀溶液,冰水浴10 min。水浴完成后,12 000 r/min離心10 min,取上清加入新的離心管,加入10 μg磁珠,混勻,再加入1/2體積分數PEG/NaCl溶液,混勻5 min。之后用磁力架磁力吸附棄上清,用1 mL 75%乙醇清洗3次,37 ℃烘箱干燥10 min。干燥完成加入100 μLTE緩沖液,65 ℃水浴10 min,磁力吸附取上清加入到新的離心管,離心管中液體即為提取的豌豆DNA。

1.5 乳膠微球與抗體偶聯

乳膠微球與抗體偶聯參考文獻[15]方法并稍做修改。取1 mL0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH=8.2),30 μL 10 mg/mL EDC和30 μL 10 mg/mL NHS,渦旋混勻,加10 μL彩色羧基化聚苯乙烯乳膠微球,混勻,超聲10 s,孵育30 min。孵育完,13 000 r/min離心15 min,棄上清,1 mL硼酸鹽緩沖液重懸,超聲10 s,加4 μL 1 mg/mL FITC抗體,渦旋混勻,孵育2 h后,加100 μL BSA封閉1 h。封閉完,13 000 r/min離心15 min,棄上清,100 μL BSA重懸,即偶聯完成。

1.6 PCR擴增及電泳檢測

PCR擴增體系為25 μL,該體系含有1 μL DNA提取物、10 mmol/L 10×Buffer、待優化的上下游引物、0.2 mmol/L的dNTP、待優化的MgCl2和1 U Taq DNA聚合酶。樣品在PCR儀(Bio-Rad)中進行擴增,擴增條件為95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,在待優化的退火溫度下退火30 s,72 ℃延伸30 s,3個循環,最終72 ℃延伸5 min。在相同條件下用水代替提取的模板DNA作為陰性對照。以1×TBE為緩沖液,4S Red plus為核酸染料,經3%瓊脂糖電泳鑒定。

1.7 試紙條組裝和檢測過程

LFS由5部分組成,包括裝載樣品溶液的樣品墊、裝載偶聯了FITC抗體的乳膠微球結合墊、固定識別分子的硝酸纖維素膜、吸水墊和支撐所有組件的支撐卡。抗FITC抗體的二抗和SAV分別固定在NC膜上作為豌豆檢測的控制線(T線)和檢測線(C線)。用含有0.05 mol/L Tris HCl(pH=8.0)、0.15 mol/L NaCl和0.25% Triton X-100的緩沖液使樣品墊飽和。用含有0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)、5%蔗糖、1%海藻糖、0.3%吐溫20和0.25%PEG-20000的緩沖液預處理結合墊。此外,將5 μL制備的偶聯FITC抗體乳膠微球滴加在結合墊上。所有處理過的組分在37 ℃下干燥2 h。LFS檢測過程是將5 μL PCR擴增產物和30 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)預混合,然后直接滴加在試紙條上的樣品墊,5～10 min后觀察T線和C線顯色情況。

2 實驗結果與分析

2.1 實驗檢測原理

本實驗的操作過程及原理如圖1所示。簡單地說,通過磁珠法提取各豆類的DNA,加入Biotin和FITC分別修飾上游引物和下游引物,常規PCR擴增得到Biotin和FITC雙修飾的目標產物,然后經過試紙條檢測。試紙條檢測過程中,當有目標產物時,產物一端FITC與結合墊上乳膠微球偶聯的FITC抗體通過抗原抗體識別,而另一端Biotin被T線上SAV捕獲從而顯色,未結合的乳膠微球被C線上的二抗捕獲顯色;相應地,當沒有目標產物時,T線不會顯色,而C線上二抗會捕獲未結合的乳膠微球上的抗體而顯色。

圖1 實驗檢測原理

2.2 引物設計與可行性驗證

引物設計是實驗的關鍵,設計過程中要考慮引物的特異性,若出現非特異性擴增,則試紙條會出現假陽結果。此外,加工過程中DNA完整性會被破壞,因此選取的擴增片段盡量要短。本實驗引物設計過程中,首先通過美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)找到豌豆MEY基因差異序列,然后使用Primer5軟件設計得到本實驗所用的引物,引物序列見表1所列。該引物通過基于局部比對算法的搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)檢索,只能擴增出豌豆MEY基因,擴增片段大小為101 bp,符合實驗要求。此外,電泳和試紙條的預實驗結果也表明該引物的可行性。

表1 引物序列

2.3 PCR的優化分析

因為本實驗采用PCR和LFS相結合的方法,需要考慮PCR的擴增效率和非特異性擴增,擴增效率影響檢測的靈敏度,非特異性擴增特別是引物二聚體會導致試紙條出現假陽,所以需要對PCR條件進行優化。影響PCR條件包括模板量、退火溫度、dNTP、引物、循環數和鎂離子等,本研究就退火溫度、引物量和鎂離子3個重要因素進行優化,結果如圖2所示。

退火溫度是PCR的關鍵因素,直接影響引物的結合效率,溫度過高引物結合效率低甚至無法結合,過低結合特異性低[16]。圖2a中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～8分別代表退火溫度為55.0、56.0、57.3、59.0、61.3、63.1、64.3、65.0 ℃。由圖2a可知:泳道1～4條帶亮度幾乎相同;從泳道4(59.0 ℃)后,條帶逐漸變暗,擴增效率逐漸降低;泳道6(63.1 ℃)以后沒有目標條帶;空白對照組也未出現引物二聚體。因此選取退火溫度為59.0 ℃進行鎂離子優化分析。

圖2 PCR條件的優化結果

鎂離子是Taq DNA聚合酶發揮作用的活性中心,鎂離子濃度的高低會影響酶的活性,進而影響反應的擴增效果。圖2b中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～7分別代表鎂離子濃度為1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L。由圖2b可知,泳道1～7均在101 bp附近出現唯一的目標條帶,泳道1條帶亮度較低,泳道2(1.75 mmol/L)以后條帶亮度幾乎一樣,因此選取鎂離子濃度為1.75 mmol/L進行引物優化分析。

引物量是PCR另一個重要因素,過低影響擴增效率,過高影響特異性。圖2c中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～7分別代表修飾引物濃度為0.02、0.04、0.08、0.12、0.20、0.30、0.40 μmol/L。由圖2c可知,泳道1～7均在101 bp附近出現唯一的目標條帶,且1～5條帶亮度隨引物濃度的增加條帶越亮,泳道5(0.20 μmol/L)條帶達到最亮,泳道6和7條帶亮度不再增加,說明最佳修飾引物加入量為0.20 μmol/L。

2.4 特異性檢測結果

特異性是實際應用的關鍵,本文選取8種常見的豆類,這些豆類在綠豆加工過程中經常會涉及到,因此適合用來作特異性分析。針對豌豆特異性檢測,本文利用上述優化好的條件進行PCR擴增,最后通過LFS檢測,結果如圖3所示。圖3中，試線條1～8分別代表豌豆、大豆、綠豆、黑豆、紅豆、蠶豆、蕓豆、鷹嘴豆，由圖3可知,只有試紙條1(豌豆)T線呈陽性結果,其他試紙條均為陰性,灰度掃描圖也相對應。這表明該測定方法對目標物種具有高度特異性,不會導致其他物種的錯誤識別。

圖3 特異性檢測結果

2.5 靈敏度檢測結果

為了進一步檢測PCR-LFS方法的靈敏度,將提取質量濃度為120 ng/μL豌豆DNA模板進行倍比稀釋,依次稀釋為原來模板的1/10、1/100、1/1 000、1/10 000、1/100 000,各取1 μL模板進行檢測,檢測結果如圖4所示。

圖4 靈敏度檢測結果

圖4中,試紙條1～7對應加入豌豆DNA的量為120、12、1.2、0.12、0.012、0.001 2、0 ng,結果顯示試紙條1～4檢測線都顯色,且顯色顏色逐漸降低,5～7沒有顯線,灰度掃描圖也相對應,說明本實驗方法的最低檢測線為0.12 ng。

2.6 樣品摻假檢測結果

考慮本實驗方法的實際應用效果,模擬了綠豆中豌豆摻假的過程,將豌豆粉按照質量分數10.0%～0%摻入到綠豆粉中,混勻,取50 mg摻假樣本提取DNA,用建立的PCR-LFS方法檢測,檢測結果如圖5所示。圖5中，試線條1～9分別對應的豌豆粉質量分數為100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%，從圖5可以看出，試紙條1～6的T線顯色,且顏色逐漸變淺,試紙條6(0.5%)以后不顯色,灰度掃描圖也相對應,說明最低可檢測的樣品摻假量為0.5%?？紤]到實際摻假情況,商家為自身利益摻假豌豆量一般高于1.0%,因此本方法最低0.5%摻假可檢測結果完全滿足實際的檢測要求。

圖5 摻假檢測結果

3 結 論

本文以豌豆特異性基因為基礎,采用PCR-LFS檢測技術,建立一種快速、簡便的摻假豌豆成分檢測方法。實驗設計了豌豆的特異性引物序列,并驗證了引物的可行性,為了保證PCR的擴增效率和特異性,分別對退火溫度、修飾引物濃度和鎂離子濃度進行優化,最后進行LFS檢測。該方法既擁有PCR特異性強、靈敏度高的特點,又具有LFS的快速、簡便的優勢,有利于簡化操作步驟,縮短檢測時間,保護實驗人員的安全。此外,只需要改變特異性引物和擴增條件,就能對其他豆類品種進行鑒定,在物種認證和追溯性方面具有廣泛的應用價值。