薄荷油納米乳液的制備及抗菌特性研究

陳瑩瑩, 白禮濤, 劉 抗, 李強明, 羅建平, 查學強

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

薄荷油(peppermint oil,PO)是一種呈薄荷香味的無色或淡黃色澄清液體,具有祛除異味,防腐、抑菌及驅蟲等功效,常添加在糖果、糕點等加工食品、飲料、化妝品中,尤其是運用其抗菌和抗真菌活性作為食品防腐劑在食品中廣泛應用[1]。由于其沸點低、易揮發、不溶于水、生物利用率低，極大程度地阻礙了其在食品領域中的應用[2]。因此,基于成本效益低、生物相容性好、易于制備等特點,開發一種水包油乳液的輸送系統,從而提高PO的水溶性及生物利用率是目前被廣泛研究的熱點。

近年來,水包油型乳液被廣泛用于包埋疏水性生物活性物質,在化妝品、制藥和食品工業都有廣泛應用[3]。乳液主要可根據其粒徑分為普通乳液(>200 nm)和納米乳液(50～200 nm)[4]。納米乳液因其納米級粒徑而具有極高的表面活性和吸附性,常用于構建營養素的遞送體系。同時,納米乳液被認為是一種近熱力學穩定體系[5],在其貯藏過程中不會出現聚集、絮凝、沉淀、奧氏熟化等現象[6]。

本文以乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)和蓮藕支鏈淀粉(lotus root amylopectin,LRA)通過干熱反應偶聯得到的復合物WPI-LRA作為乳化劑,高壓均質制備穩定的水包油型PO納米乳液,研究不同油相比、芯壁比(CWR),對乳液粒徑、儲存穩定性的影響以及納米乳液抑菌特性的測定。

1 材料與方法

1.1 材料

無花藕(合肥大興農產品批發市場);薄荷油(蘇州嘉葉生物科技有限公司);異丙醇、乙醇、異辛烷(國藥集團化學試劑有限公司);甲醇(西隴化工股份有限公司);超純水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.2 儀器

79HW-1恒溫磁力攪拌器(常州國宇儀器制造有限公司);FD-1D-80真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司);AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);Nano-Zs90型納米粒度及Zeta電位分析儀(英國Malvern儀器公司);DHG-9070A 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

(1) WPI-LRA復合物乳化劑的制備。稱取質量比固定的WPI與LRA粉末相混合,完全溶解在蒸餾水中,冷凍干燥。收集冷凍干燥后得到的粉末,放置在底部盛有飽和KI溶液的干燥器中反應13.6 h,得到WPI-LRA復合物[7],待使用前,樣品一直存放在4 ℃冰箱。

(2) 乳液的制備。WPI-LRA復合物在水中分散后不斷攪拌(3 h),得到乳化劑水相溶液(質量分數為1%)。純PO、不同體積比的PO與大豆油(soybean oil,SO)(1∶5、1∶1、5∶1)分別作為油相。乳化劑水相溶液與油相混合后,經高速均質(20 000 r/min,1 min)得到粗乳液,再分別在10、40、70、105 MPa的高壓下均質1～7次從而得到粒徑不同的乳液[8]。高壓均質制備樣品時,通過設定15 ℃的冷卻水系統溫度來控制均質閥和樣品出入口的溫度。

(3) 乳液粒徑的測量。乳液經濃度為8 mmol/L、pH=7.0的磷酸緩沖液稀釋至半透明狀態,從而可以避免多次散射效應。使用動態光散射儀(dynamic light scattering,DLS)在室溫下測定乳液的平均粒徑。

(4) 乳液微觀結構的表征。在載玻片上分散少量新鮮制備的乳滴,使用普通光學顯微鏡(400倍)觀察其形態并拍照。

(5) 實驗菌懸浮液的制備。經固體培養基挑取金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii),并接種到LB肉湯液體培養基上。醒菌24 h使其活化后,再分別取1% 的金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌于新鮮的LB中備用。

(6) 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測定。首先加入經滅菌處理后的LB液體培養基100 mL置于錐形瓶中,然后向錐形瓶中分別加入6.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mL的PO和PO納米乳液,再分別加入金黃色葡萄球菌或阪崎腸桿菌懸浮液1 mL,在保溫箱中培養10 h后,觀察錐形瓶中液體的渾濁情況[9]。

(7) 菌落生長曲線的測定。為了測定金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌2種細菌在純PO和包埋PO的納米乳液的生長情況,菌落懸浮液經培養75 h,每隔一段時間取2 mL液體于比色皿中,利用紫外分光光度計測定OD600值。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3次,數據取(平均值±標準差),采用SPASS數據處理軟件對實驗數據進行分析處理。

2 結果與討論

2.1 油相對乳液粒徑的影響

2.1.1 均質壓力對乳液粒徑的影響

本文以PO作為油相,分析不同均質壓力及均質次數對乳液粒徑的影響。首先配制質量分數為1%的WPI-LRA乳化劑水相溶液,再將PO分散在WPI-LRA乳化劑水相溶液中,使其質量分數為10%。并分別在10、40、70、105 MPa的高壓下均質7次得到乳化液。利用動態光散射儀測定不同均質壓力及不同均質次數下的乳化液的平均直徑。不同均質壓力下乳液的微觀結構如圖1所示,從圖1可以看出，乳液粒徑隨著均質壓力的增大而增大,這可能是由于這類精油物質自身特性導致的。文獻[10]研究表明裝載2種不同精油時,液滴尺寸也表現出相同的趨勢。這種現象可以用奧氏熟化(Ostwald ripening)理論解釋,由于油的易擴散性,小液滴匯集成大液滴從而導致平均粒徑增大[11]。

圖1 3種不同均質壓力下乳液的微觀結構

2.1.2 均質次數對乳液粒徑的影響

本文以混合油相作為油相,研究在不同均質次數下制備得到的乳液粒徑的變化情況。首先,SO和PO以不同比例混合,再將混合油相分散在質量分數為1% 的WPI-LRA乳化劑水相溶液中,在105 MPa下進行高壓均質，測定的粒徑結果如圖2所示,從圖2可看出,當SO體積比逐漸增大且均質次數逐漸增多到7次時,乳液粒徑可以達到納米級。文獻[12]的研究結果與本文一致,向油相中添加一些水不溶性成分(如SO)時,可以有效抑制出現奧氏熟化現象。SO因其極性較低、密度較高、黏度大的特性常被廣泛用于增溶劑或載體溶劑,從而提高色素、精油、香料、維生素等物質的生物利用率。

圖2 均質次數對乳液粒徑的影響

2.2 混合油相對乳液黏度和粒徑的影響

混合油相成分對乳液黏度和粒徑的影響如圖3所示。從圖3可以看出,不同比例的混合油相對乳液的粒徑和黏度有很大的影響。隨著SO體積分數的增加,粒徑逐漸減小,黏度呈現上升的趨勢，當SO體積分數達到20%時,與純PO為油相制備的乳液相比,粒徑從1 592 nm減小到310 nm，隨著SO體積分數繼續升高,粒徑小幅減小。同時,隨著SO體積分數的增大,乳液的黏度由25.6 mPa·s增加到45.1 mPa·s。SO體積分數對液滴粒徑和黏度的影響趨勢與文獻[13]的報道一致。經分析,液滴的直徑會極大程度地影響乳液的流變行為[14]。在同一剪切速率下,粒徑的減小會使黏度升高。降低的粒徑和提高的黏度有益于提高乳液的穩定性。綜上所述,使用經PO和SO組成的混合油相可以有效抑制純PO發生奧氏熟化。

圖3 混合油相對PO乳液粒徑和黏度的影響

2.3 CWR對乳液粒徑和多分散系數的影響

CWR指芯材與壁材之間的質量比,其對乳液包載效率有很大影響。乳液在工業制備過程中,CWR與負載營養素的含量呈正相關趨勢,有益于提高工廠的效益。但CWR也不能無限度增大,由于負載過量的營養素或藥物時,極易導致絮凝或凝聚等現象發生,從而使得乳液的物理化學性質發生相應變化。只有選擇合適的CWR,才可以制備出合適的乳液。因此,本研究以質量分數為1%的WPI-LRA為乳化劑,SO和PO為混合油相,均質壓力為105 MPa的條件下,分析不同芯材載量對乳液粒徑和多分散指數(polydisperse index,PDI)的影響,從而探究制備乳液最合適的CWR,結果見表1所列,由表1可知，當CWR由1∶3升高到3∶3時,乳液的粒徑只有略微的改變,隨著CWR升高到4∶3時,乳液粒徑由182 nm升高到251 nm。主要原因在于油相比過大時,導致乳化劑并沒有被完全乳化而出現了懸浮,營養素沒有被完全包載。文獻[15]指出,可以根據PDI值的大小判斷乳液的分散情況與均一性，較小的PDI值表明乳滴分散集中,粒徑分布較窄,乳液均一性好。由表1可知,CWR為3∶3時制備的乳液的粒徑和PDI值均最小,說明這是最適宜制備乳液的CWR值。

表1 不同CWR對乳液粒徑和PDI的影響

2.4 乳液儲藏穩定性分析

30 d內乳液粒徑的變化如圖4所示。

圖4 儲藏時間對30 d內乳液粒徑變化

從圖4可以看出,乳液的粒徑會隨儲藏時間(1、15、30 d)的變化而發生相應改變,并且不同油相比(1∶5、1∶1、5∶1)制備的乳化液粒徑均呈現出逐漸增大的趨勢。V(PO)∶V(SO)為1∶5時,儲藏30 d后乳液的粒徑從176 nm增加到260 nm；V(PO)∶V(SO)為1∶1時,儲藏30 d后乳液的粒徑從205 nm增加到319 nm,而V(PO)∶V(SO)為5∶1時,儲藏30 d后乳液的粒徑從210 nm增加到344 nm。由此可以看出,PO體積比較高的油相制備的乳液的初始粒徑和最終粒徑都相對較大,且儲藏過程中略微出現了油滴懸浮的現象。

2.5 乳液的抑菌特性分析

2.5.1 最低抑菌濃度分析

最低抑菌濃度(MIC)指能夠抑制細菌生長、繁殖的最低藥物濃度。本文測定的MIC指制備的PO乳液抑制金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌生長繁殖的最低濃度。乳液抑菌結果分析見表2所列。表2中：+表示加入該物質；-表示未加該物質。從表2可以看出,純PO與PO乳液對金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌2種菌株的MIC均為0.50%,說明與純PO相比,納米乳液乳化體系對這2種菌株的抑制效果一致,并不會改變薄荷油的抑菌能力。原因在于納米乳化體系可以有效保護包埋的營養物質,阻止其出現氧化或揮發。文獻[16-17]研究結果與本文結果一致。

表2 乳液抑菌結果

2.5.2 菌落生長曲線分析

通過將金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌與最低抑菌濃度的PO和納米乳液包埋的PO共同培養,觀察在75 h內對生長曲線的影響,從而測定其對這2種菌株生長情況的影響。培養測定時間主要分為以下4個階段：緩慢生長期(0～5 h)；快速生長期(5～18 h)；穩定期(18～20 h)；凋亡期(20～45 h)。菌落的生長曲線如圖5所示,由圖5可知,單純乳液組處理的金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌的OD600曲線十分相似,表明單純乳液并沒有抑制細菌的生長，2種菌株對PO和PO納米乳液的敏感程度不同,表現為其OD600在不同時間達到最大值,且其最大值也不同;PO處理的阪崎腸桿菌在18 h時達到最大值0.875,而經PO乳液處理的阪崎腸桿菌在12 h就達到最大值0.788。對于金黃色葡萄球菌,經PO處理與PO納米乳液處理時,OD600均在12 h時達到最大值,然而PO組的OD600值為0.900,PO納米乳液處理時的OD600最大值為0.778。因此,不同菌屬經PO乳液處理的OD600值均小于純PO組。

雖然純PO和PO納米乳液對2種菌株的MIC相同,但PO納米乳液更能抑制2種菌株的生長,表現出持續更長時間的抑菌能力。主要是PO經納米乳液包埋后,一方面是由于納米級粒徑降低了乳液的傳質阻力,有利于菌株被動吸附PO,因而PO的抑菌能力有所提高;另一方面由于納米乳化體系可以保護PO的有效生物活性成分,且提高了PO的溶解度和理化穩定性,增大了生物活性成分與微生物的作用幾率,從而得以延長抑菌時間[18]。

圖5 菌落的生長曲線

3 結 論

PO和SO組成的混合油相可以有效抑制發生奧氏熟化現象。當PO與SO的體積比為1∶5時,經高壓均質7次后,可以得到粒徑為176 nm的納米乳液。設定CWR為3∶3時,制備得到的乳液粒徑和PDI均較小,為最合適的CWR。乳液儲藏穩定性實驗結果表明,不同PO與SO體積比的混合油相制備的乳液粒徑均隨儲藏時間的延長而增大,而且PO體積比越高的油相制備的乳液初始粒徑和最終粒徑都相對較大,并且儲藏期間出現了油滴懸浮現象。通過測定MIC可知，純PO和經納米乳液包埋的PO的MIC相同，然而比較2種菌株恒溫培養 75 h 的生長曲線可知,PO納米乳液具有比PO持續時間更長的抑菌能力,即由WPI-LRA包埋PO的納米乳液具有時效更長的抑制微生物生長特性。