基于DNA模板的熒光銅納米粒子研究進(jìn)展

周帥龍

（溫州大學(xué)，浙江 溫州 325035）

熒光分析法是一種常用的物質(zhì)定性和定量分析方法，它具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、方法簡單等優(yōu)點，常用于各種物質(zhì)的檢測分析中[1]。在諸多熒光材料中，金屬熒光納米材料在近年來廣受關(guān)注。金屬熒光金屬納米粒子是由貴金屬（Au、Ag、Cu等）與生物分子（DNA、蛋白質(zhì)等）為原料合成的新型熒光金屬納米材料，具有突出的生物相容性[2-5]。另外此類熒光納米材料具有超大Stokes位移特性，能夠避免生物物質(zhì)自熒光干擾，因此在環(huán)境檢測分析、生物傳感方面極具競爭力[6-9]。

熒光金屬納米粒子是原子和大型納米顆粒之間的中間過渡態(tài)，在溶液中一般不能穩(wěn)定存在。為了降低巨大的表面能，小型的納米粒子傾向于聚集成更大的顆粒，從而導(dǎo)致熒光性質(zhì)發(fā)生變化[10]。因此，需要一個合適的支架或模板以抑制其聚集，這些模板是一些對金屬離子具有高親和力的陰離子和螯合配體，如硫醇、聚合物、DNA、蛋白質(zhì)等。

在熒光金屬納米材料的各種模板中，DNA因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而成為最優(yōu)秀的模板之一。與其他模板相比，以DNA為模板具有一系列顯著的優(yōu)勢：DNA的序列可編程，熒光金屬納米材料的種類和特征可隨DNA模板序列和結(jié)構(gòu)的變化而變化；DNA分子通過與其他單元（如—SH、—NH2等有機(jī)基團(tuán)、互補(bǔ)序列、適配體、DNA酶等）結(jié)合，在功能修飾方面具有優(yōu)越的靈活性，也使得熒光納米粒子的應(yīng)用更加多樣化；以DNA為模板合成方法簡便，條件溫和。將制備好的 DNA/金屬離子配合物與適當(dāng)?shù)倪€原劑在室溫下反應(yīng)幾分鐘到幾小時即可完成的合成。此外，DNA是一種生物大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，這使得DNA模板化合成熒光金屬納米材料在生化傳感方面具有巨大的潛在應(yīng)用價值[11-13]。

目前，已驗證DNA堿基中的氮可以與許多金屬離子配位：Ag+結(jié)合位點為嘧啶上的N3和嘌呤上的N7，Au3+與腺嘌呤上的 N7有較高的親和力，Cu2+能與胸腺嘧啶上的N3結(jié)合。DNA與金屬離子形成DNA-金屬離子復(fù)合物后，特定還原劑將金屬離子還原成金屬原子并聚集形成熒光金屬納米粒子[14-16]。DNA核苷和金屬配位位點的化學(xué)結(jié)構(gòu)及DNA-熒光納米粒子合成示意圖如圖1所示。

圖1 DNA核苷和主要金屬配位位點的化學(xué)結(jié)構(gòu)及DNA-熒光納米粒子合成示意圖

1 DNA-熒光銅納米粒子合成與應(yīng)用

截至目前，已報道了各種不同性質(zhì)的 DNA-熒光金屬納米粒子，如金、銀、銅納米粒子。與金、銀相比，銅的化學(xué)性質(zhì)更活潑（φ?[AuCl4]-/Au為1.002 V、φ?(Ag+/Ag) 為 0.799 V，φ?(Cu2+/Cu) 為0.339 V），因此CuNPs更容易被氧化。所以，熒光銅納米粒子的合成更為嚴(yán)謹(jǐn)，其熒光也相對不穩(wěn)定。但是，CuNPs的熒光發(fā)射中有一個超大Stokes位移（~270 nm），且其強(qiáng)度與DNA模板的長度成正比。此外，由于銅作為生命系統(tǒng)的微量營養(yǎng)元素，銅納米材料比其他重金屬納米材料具有更強(qiáng)的生物相容性和環(huán)境友好性。因此，DNA-熒光銅納米粒子作為一種原位合成的納米探針在生物傳感器的開發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景[17]。

2010年，MOKHIR[18]小組首次報道了 dsDNA可以模板化形成熒光銅納米粒子。Cu2+與硬 Lewis堿（氧原子）或中Lewis堿（氮原子）結(jié)合后Cu2+被還原為Cu+，隨后Cu+通過歧化反應(yīng)在dsDNA上生成Cu0，進(jìn)而生長成為CuNPs（λex為340 nm、λem為605 nm）。另外，他們還發(fā)現(xiàn)納米顆粒的大小與DNA模板中的堿基對數(shù)量成正比，而作為對照組的ssDNA與肽核酸(PNA)/DNA雙鏈?zhǔn)峭耆珶o效的。于是他們推斷：CuNPs的主要成核位點在dsDNA雙鏈間的凹槽之間；電荷的多少也非常重要，電荷較多的dsDNA更容易引起納米粒子的成核與生長。Cu2+以DNA雙鏈為模板合成CuNPs示意圖如圖2所示。

圖2 Cu2+以DNA雙鏈為模板合成CuNPs示意圖

2013年，WANG 課題組發(fā)現(xiàn)聚T-ssDNA同樣可以有效合成 CuNPs （λex=340nm、λem=615nm），且納米粒子的尺寸與 ssDNA中堿基 T的聚合度成正比。研究中發(fā)現(xiàn)，只有聚T-ssDNA能夠有效合成熒光銅納米材料，而聚 A、G、C-ssDNA則不行，這是由于只有T堿基才能與Cu2+特異性結(jié)合并還原為Cu0，然后沿著聚T-ssDNA模板進(jìn)一步成核生長[19]。

2014年，同樣是WANG課題組以特異性的聚(AT-TA)-dsDNA 為模板用于合成了 CuNPs （λex為590 nm、λem為 340 nm），且其熒光強(qiáng)度不僅與聚(AT-TA)-dsDNA的長度成正比，而且與序列中 AT的聚合度成正比[20]。

然而，CuNPs光穩(wěn)定性較差，這使其在應(yīng)用中存在巨大障礙。為了克服這一缺陷，2014年WANG等引入了 DNA滾動循環(huán)復(fù)制（RCR）技術(shù)[21]。該技術(shù)可以產(chǎn)生長ssDNA，其中包含數(shù)千個周期性復(fù)制的圓形模板。通過引入互補(bǔ) DNA，使得串聯(lián)dsDNA用于形成串聯(lián)dsDNA-CuNPs，這極大地增強(qiáng)了CuNPs的穩(wěn)定性。因為通過引入大量無關(guān)ssDNA可以消耗大量的·OH，而且隨著DNA模板濃度的增加，CuNPs的熒光強(qiáng)度會增強(qiáng)。

CuNPs的形成高度依賴于DNA的長度，其熒光發(fā)射信號與DNA模板的長度成正比，這為生物傳感器的開發(fā)提供了一種可行的策略。2013年，WANG運(yùn)用該策略開發(fā)了一種用于核酸酶檢測的無標(biāo)記熒光方法[22]。其中，聚T-DNA序列（T30）在無核酸酶的情況下保持長鏈狀態(tài)，可以有效地合成CuNPs。在核酸酶存在下，T30被酶切成單核苷酸或寡核苷酸片段，因此熒光減弱。最終此策略實現(xiàn)了對核酸酶的選擇性高靈敏檢測，如圖3所示。

圖3 DNA-CuNPs生物傳感器用于核酸酶檢測

2017年，OUYANG[23]課題組在聚T-DNA序列3’端設(shè)計了一個 ATP適配體（富 G-DNA序列）。當(dāng)ATP存在時適配體形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，有效地阻礙適體衍生的寡核苷酸的消化，5’端的聚T-DNA序列可以作為模板合成 CuNPs。而當(dāng)無 ATP時，DNA長鏈被消解為短鏈，則無法形成CuNPs。最終，以此建立起了一種簡便的用于檢測ATP濃度的方法。

2021年，LI[24]等報道了一種簡單的酶和無標(biāo)記熒光生物傳感器定量檢測miRNA。DNA檢測探頭包含聚T-DNA序列（T20）、目標(biāo)分子檢測DNA序列及聚G-DNA序列。首先，DNA片段以柔韌的ssDNA形式存在，導(dǎo)致 PET過程中 G/hemin配合物與DNA/CuNPs之間的長度相對較短，導(dǎo)致了較高的熒光猝滅效率。與目標(biāo) miRNA混合后，柔性 ssDNA的檢測片段轉(zhuǎn)變?yōu)閯傂噪p鏈，導(dǎo)致電子供體到受體的空間增大，從而導(dǎo)致熒光發(fā)光。

2021年，WANG[25]又報道了一種以DNA為模板合成的具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射增強(qiáng)（AIEE）特性的銅納米組裝體（CuNASs）。該DNA樹枝狀分子CuNASs在血清中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，并可被 Pb2+快速猝滅，以此可實現(xiàn)對 Pb2+離子的高靈敏度選擇性熒光檢測。

2 結(jié)語

近年來，熒光金屬納米材料因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和在生物傳感、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，引起了人們的極大興趣[26-31]。在諸多熒光納米材料研究中，以DNA為模板合成CuNPs在生物傳感器的開發(fā)中具有明顯的優(yōu)勢：制備效率高、操作簡單、合成動力學(xué)速度快；熒光性能好，如紅色發(fā)射，超大Stokes位移；環(huán)境友好、生物安全；易于與其他功能單元集成，實現(xiàn)多功能應(yīng)用[32-34]。但是，盡管基于DNA合成CuNPs的生物傳感器的研究在近年來取得了顯著的進(jìn)展，但這一研究領(lǐng)域仍處于早期階段，仍有很大的研究和改進(jìn)空間。如在基礎(chǔ)方面，雖然已有一些關(guān)于DNA模板化合成CuNPs的成功案例，但對此機(jī)理的研究還不夠透徹。另外在應(yīng)用方面，CuNPs的光穩(wěn)定性比較脆弱，容易發(fā)生氧化，需要通過精心控制實驗條件、合理操縱微環(huán)境等策略來提高其穩(wěn)定性。對此，還需要眾多科研工作者進(jìn)一步努力探索，使 DNA-CuNPs在生物傳感、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮更大的價值。