聚偏氟乙烯（PVDF）膜的漆酶固定化及其應用研究進展

周東銳，張獻坤，張佳琦

（沈陽建筑大學，遼寧 沈陽 110168）

漆酶作為一種常見的氧化還原酶，由于其易獲取、催化效率高等特點被廣泛應用于污水處理中，目前國內漆酶的應用主要集中在含酚廢水處理、染料廢水脫色、降解有毒物質等方面。特別是其反應產物是水，不產生二次污染，因此其本質上是一種環保型酵素。

1 漆酶簡介

漆酶，又稱對苯二酚氧化酶，屬于多銅氧化酶類，具有高效的氧化性和穩定性。漆酶來源廣泛，主要分布于動物、植物、微生物中，大致分為漆樹漆酶和真菌漆酶兩類。真菌漆酶屬于胞外蛋白，可以通過生物工程、微生物培養等方式大量獲取，因此成為眾多學者的研究對象。漆樹漆酶又稱為生漆，主要從漆樹上獲取，雖然我國生漆資源豐富，但目前對于漆樹漆酶仍缺乏深入的研究[1-2]。

漆酶氧化還原電位各不相同，可以氧化多種化合物，甚至包括二價錳以及多種脂在內[3-4]。漆酶氧化還原電位主要受相對分子質量和銅離子周圍氨基酸的空間位阻的影響，相對分子質量或銅離子周圍氨基酸的空間位阻越大，漆酶的氧化還原電位越高。漆酶對底物的氧化機制大致可分為3種：漆酶將底物直接氧化成激發態分子；漆酶利用介導介質的激發態氧化氧化還原電位較高的底物；漆酶通過加入黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔酶促進催化底物。雖然漆酶的氧化范圍廣，但游離態漆酶的熱和酸堿穩定性較差，且難以重復使用，因此，它的應用價值有限。將漆酶固定化不僅可以有效地解決這些問題，還可以解決游離態漆酶漏失的問題，減少外部環境對漆酶的影響，擴大其應用前景。

2 漆酶固定化技術

對幾種固定化方法的特點及常用載體進行對比，結果如表1所示。

表1 固定化技術常用方法

目前漆酶的固定化技術有共價結合法、吸附法、交聯法、包埋法等[5-8]，每種技術都離不開載體，因此，載體的選擇顯得尤為重要，直接影響了漆酶的固定化效果和利用率[9-12]。研究者們通過對比不同的載體材料進行固定化研究，對酶固定化技術不斷創新。

3 PVDF膜表面的漆酶固定化方法研究

高分子膜材料是材料領域的后起之秀，具有選擇透過性和結構伸縮性，在催化過程中實現物質分離[13]。PVDF膜更是由于其較高的機械強度和熱穩定性成為理想的固定化載體材料。但是目前在漆酶的膜固定化方面仍缺少詳盡的介紹。按漆酶的加入時間可分為成膜前固定和成膜后固定兩種，但是大部分方法都需要對膜載體進行改性處理，通過物理、化學等手段引入大量易于漆酶結合的官能團，提高漆酶的固定化效果[14-15]。

3.1 成膜前漆酶固定化方法

成膜前固定漆酶就是將漆酶與鑄膜液混合均勻，然后利用相轉化法制備多孔膜，從而將漆酶包埋于聚合物基質中形成納米顆粒，這是唯一一種不需要對膜表面進行修飾的方法，而且固定化后的漆酶不易脫落，因此，可大大減少成本。劉瑞紅[16]等采用靜電紡絲技術，根據自制的裝置在生成 PVDF中空纖維膜的同時原位固定漆酶。經檢測發現高達81.3%的漆酶成功固定在膜片表面，且固定化漆酶可保持游離態漆酶80%的活性，在經過7天儲存后，其相對活性僅降低了18%。這有力地說明膜前固定在平衡酶活性和固定效率兩方面具有較大的優勢。

但目前膜前固定存在兩大難點：第一，由于漆酶存活的最適溫度為 25～40 ℃，而制膜時鑄膜液溫度較高，通常高于漆酶最適合存活溫度，因此成膜前固定化漆酶，首先要解決漆酶在高溫下的存活和熱穩定性問題；第二，漆酶溶液中存在水分，在與鑄膜液混合時易團聚成團，無法成膜。

現有的提高漆酶熱穩定性的方法有蛋白質工程、固定化、化學修飾、非共價修飾等。蛋白質工程最常見的是基因誘變，但由于該技術相對復雜，目前對這方面的研究相對較少，鑒于國內目前已掌握了超過300個蛋白質三維結構及其規律性認識，蛋白質工程因其可以定向地賦予酶蛋白學者們想要的功能，必將成為未來新的研究方向。由于其化學修飾是通過“切割”或“剪接”主鏈和“化學修飾”側鏈來改造蛋白質分子，這種方法使酶結構破壞嚴重，極大程度地改變了酶的性能。非共價修飾可有效地保護酶的天然構象，使酶形成更準確的催化部位，使其更易與底物相結合。張全升[17]等用二氧化硫脲和 L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽對漆酶進行改性處理，并在 72 ℃高溫下考察改性后的漆酶活力，結果發現改性漆酶活性分別提高1.3%和56.9%。這種方法操作簡單、反應時間短，是所有改性方法中最溫和的一種，在酶改性領域應用廣泛。花秀夫[18]等在二甲基亞砜和鄰苯二甲酸酐溶液中對漆酶進行修飾，結果發現修飾漆酶與天然漆酶光學特性相似，在 55 ℃時修飾漆酶的半衰期較天然漆酶長，適宜的pH范圍從5.9～7.8變為4.5～8.4。這表明該種方法有效地提高了漆酶的熱穩定性和酸堿穩定性。何小勇[19-20]等采用添加多羥基化合物的方法提高漆酶熱穩定性，分別考察肌醇、葡萄糖、甘露醇、甘油、山梨醇等 5種物質在 20、30、40、50、60、70 ℃下漆酶的活力。通過對比發現在 20～60 ℃范圍內漆酶活力均呈現先增大后減小的趨勢，但酶活均高于天然漆酶，且在 70 ℃高溫下改性漆酶的半衰期遠遠高于天然漆酶。這表明多羥基化合物的加入可有效提高漆酶熱穩定性，且對改性劑添加量的不斷優化可進一步加強漆酶活力。

綜上，提高漆酶的存活溫度和熱穩定性是可行的，但目前尚沒有將其應用到漆酶的膜固定化中，未來可通過以上幾種方法對漆酶進行改性處理，或者可以將在高溫下存活下的漆酶進行富集培養，提高漆酶在高溫下的存活率，然后將改性后的漆酶加入到N,N-二甲基酰胺（DMF）溶液中，攪拌均勻后混入鑄膜液中，調整溫度后進行刮膜處理，從而實現在成膜前固定漆酶。

3.2 成膜后漆酶固定化方法

成膜后固定漆酶就基于酶固定化的幾種方法（吸附法、共價結合法、交聯法、包埋法）將漆酶固定在載體表面。相比于成膜前固定的方法，在成膜后對漆酶進行固定是目前的研究重點。

吸附法可以將制備好的PVDF膜浸泡在以一定比例配置的漆酶溶液中，利用漆酶與膜載體間的氫鍵、疏水鍵、離子鍵合力、靜電作用將漆酶固定在膜上。但這種作用力通常較小，因此需要引入不同的添加劑對膜片進行改性處理。通過對各種實驗參數的調整亦可將固定效果達到最佳。FAN[21]等采用聚多巴胺（PDA）涂覆PVDF膜片，然后在PDA涂層表面接枝聚乙烯亞胺（PEI），使其表面帶正電。采用正向過濾的方式利用靜電作用吸附漆酶。測試發現漆酶固定化純度高達 92.2%，漆酶表達活性僅為 19.6%左右，這表明漆酶固定效率更高，但同時使酶結構的靈活性受限，因此酶表現活力較低。在4 ℃、pH為4.5的條件下，經儲存45天后漆酶活性僅損失了13%，而游離態漆酶則幾乎完全喪失活性。這表明固定化使漆酶的穩定性得到了較大提高。

利用交聯法將漆酶固定在膜上，通常需要添加帶有雙官能團或多官能團的交聯劑（例如戊二醛、二羧酸），但是這種方法獲得的交聯結構機械性能差，因此常常與其他固定方法聯合使用。何洋[22]等采用原子轉移自由基聚合（ATRP）法制備聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PVDF-g-PGMA）共聚物，使膜表面引入可固定漆酶的官能團，利用共價結合的方法固定漆酶，最后利用聚醚酰亞胺（PEI）交聯漆酶固定化 PVDF-g-PGMA膜。經測試發現未經交聯的漆酶固定化膜在8 h的降解效率為71.3%，而交聯后的漆酶表現出更佳的降解效率，在8 h的降解效率可高達93.5%。在經過4次循環使用后未經交聯與交聯后的漆酶均能保持高于90%的活性，但當重復使用10次時，交聯后的漆酶可保留高于80%的活性，而未經交聯的漆酶僅剩65%的活性。

包埋法就是將配好的漆酶溶液濾過聚合物膜，在過濾過程中實現漆酶的固定。這種方法通常不需要添加交聯劑，對酶結構影響最小，但較少應用于PVDF膜上。近五年來尚未有基于PVDF膜的包埋法固定漆酶的論述。羅建泉[23]等基于“膜污染思維”采用逆向過濾的方式將漆酶包埋固定，該固定化方法較為完善，膜載體的選擇主要集中在纖維素超濾膜和聚酰胺納濾膜等方面，尚未應用于PVDF膜上，但同時也為后期PVDF膜的酶固定方法研究提供一定的理論依據。

經對比發現，不同類型的酶固定化方法各有千秋，目前還不能明確哪種就是最佳的固定化方法。這需要根據漆酶種類、聚合膜的性能等因素來具體分析。上述幾種方法雖然都不同程度地對酶活性造成了影響。但可以肯定的是，大部分固定化技術都可以有效地提高漆酶的穩定性。如何在保證漆酶活性的同時提高漆酶的穩定性將會是酶的膜固定化領域研究的重點。

4 漆酶固定化的PVDF膜在水處理中的應用

酶固定技術可大幅度延長漆酶使用壽命，提高漆酶的耐受性和穩定性，在有毒廢水中亦可保持較高活性，在多次處理后可通過化學手段進行酶清洗，實現酶的重裝載。針對不同污水應采用不同的載體及固定化方法，該機制可有效地降低成本并減少廢水中有毒組分對酶活性的影響。在酶催化氧化過程中底物通常被氧化成自由基或活性中間體，并在自偶聯反應下形成二聚體、三聚體，甚至是高聚體[24]，進而通過簡單的純化過濾技術去除。該技術以高效、無二次污染、價格低廉等優點在污水處理領域具有較好的發展前景。

4.1 在含酚廢水處理中的應用

酚類化合物污染范圍極廣，對人體、農作物、水生物等危害極大。目前，含酚廢水的處理方法大致分為生物降解、光催化、電催化等3種。酶固定化技術作為一種新型的微生物技術[25-26]在污水處理中備受矚目。微生物法與傳統的物理化學法相比具有催化效率高、簡單易控制、不會造成二次污染等優勢。而固定化漆酶由于生物密集性高，相比游離態漆酶來說，處理效果更佳。

XU[27]等采用共價鍵合法將漆酶固定到納米銅改性的PVDF膜上，經實驗發現在pH等于4時，漆酶的固定化效率最佳，可達588 mg·g-1，這種生物催化膜對 2,4,6-三氯苯酚的去除率可達 95.4%。究其原因，可能是漆酶活性中心的電子傳遞發生氧化還原反應從而將有機污染物降解成自由基，納米銅的加入加快了氧化還原反應速率，從而提高了有機污染物降解效率。

景偉侯[28]等開發了一種新型的低溫水熱（LTH）溶膠-凝膠涂層技術，在PVDF膜表面形成薄而堅固的二氧化鈦（TIO2）涂層。隨后將固定有TIO2的膜片浸泡在配好的漆酶溶液中，使漆酶共價固定在TIO2上。對該制備好的生物催化膜進行BPA（雙酚A）去除率檢測，結果發現未包覆 TIO2的生物催化膜對BPA去除率為64%左右，在經過3層包覆后去除率可高達85%以上。且經包覆TIO2后的膜在4次降解循環中監測跨膜壓力（TMP）沒有明顯增加，表明經 TIO2包覆的新型生物催化膜對染料廢水具有更高降解效率和良好的防污性能。經分析發現TIO2上存在羥基，使漆酶更加牢固地固定在膜片表面，較高的載酶率與酶活性使該膜片表現出更高的BPA降解效率。

4.2 在微量有機污染物去除中的應用

微量有機污染物是指含量少、有毒、難降解的有機污染物。這種污染物來自于地面徑流、生活污水以及工業廢水的排放，主要分為人工合成有機物（SOC）和天然有機物（NOM）兩類，對人體健康有較大的威脅[29-30]?，F有的去除辦法去除率均較低，難以滿足排放標準。

MASJOUDI[31]等采用相位反轉法制備了一種PVDF/MWCNT（多壁碳納米管）納米復合膜，并利用化學吸附法將漆酶固定。MWCNTs中羧基的存在有效提高了漆酶固定化效率，但漆酶活性有所降低，這可能與固定化過程中漆酶的變性有關。在兩種有機農藥（卡馬西平和雙氯芬酸）的去除實驗中發現，在4 h內去除27%馬西平，48 h內去除95%雙氯芬酸。這表明基于PVDF/MWCNT膜固定的漆酶是一種高效的污水處理催化劑。

5 結 論

近年來，酶固定化技術以其獨特的優勢成為環境治理領域的研究熱點，國內外的研究學者開發出一系列的新型酶固定技術，極具應用前景。與此同時，膜分離技術作為一個古老但新興的技術，經過不斷的創新發展，已經被應用于各個領域。膜材料由于其結構的可調性和較高的機械性能，成為備受關注的固定化載體材料。二者的有效結合在環境治理領域有著深遠的意義。但該項技術仍存在較大發展空間：

1）目前對于膜前固定漆酶的研究尚處于實驗室階段，如何提高漆酶的存活溫度以及找到適宜的溶劑在不形成凝固浴的同時溶解漆酶將成為未來需攻克的難題，同時目前對加入添加劑的非共價修飾研究較為廣泛，但是蛋白質工程的定向性與新穎性不可忽視，這將成為未來新的發展方向。

2）現有的幾種固定化方法各有利弊，且不同種類的漆酶，不同種類的膜材料，有著不同的固定化方法，這就需要基于大量的實驗來驗證，無法進行普遍的總結和廣泛的應用，或許在今后的研究中可以建立數據庫進行收集對比，以便找出最佳固定方案。

3）在幾種酶固定化技術中都不可避免地造成酶活性的降低，如何在保證酶活性的同時提高漆酶穩定性將會是未來創新酶固定技術的主要研究方向。

4）目前，漆酶直接固定在PVDF膜上在水處理方面應用較少，但可以采用二次改性的方式對漆酶進行固定，利用納米銅、TIO2、碳納米管等新型材料，通過更牢固的化學鍵合力將漆酶固定，從而提高降解效率。尤其是TIO2的光催化和自凈能力亦不容忽視，將其與聚偏乙烯膜結合或許可以制備出一種新型自清潔型生物催化膜。