大鼠三叉神經痛模型中小膠質細胞激活情況及經時變化

盧妍竹 張婧琦 賴文莉

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院正畸科，成都 610041

三叉神經痛是在三叉神經分布區域內突然發作的、持續數秒至數分鐘的劇烈疼痛，其發作具有周期性、陣發性等特點，發作間歇無癥狀[1-2]。疼痛由三叉神經末梢以神經沖動的形式傳遞至三叉神經節，之后進一步傳遞至延髓的三叉神經核復合體，通過丘腦經由眾多腦區調節后傳遞至大腦皮層而被感知[3]。疼痛發作時，傳入三叉神經核的痛覺信息主要由三叉神經脊束核尾側亞核（spi‐nal trigeminal nucleus caudal part，Sp5C） 處 理[4]，該區小膠質細胞可能出現激活。小膠質細胞是神經系統內固有的重要免疫細胞，對外界刺激反應靈敏，激活后形態發生明顯變化以獲得更強的吞噬及運動能力，且可以進一步釋放促炎因子參與疼痛的發生和維持[5]。周圍神經損傷引起的炎性反應以及脊髓背角神經元的過度興奮性，均為小膠質細胞激活的促進因素[6]。小膠質細胞的激活在神經病理性疼痛中起著關鍵作用，具體機制仍有待進一步研究[6]。

本研究的目的是通過經口內開口結扎大鼠三叉神經的眶下神經（infraorbital nerve，IoN）分支，引起三叉神經慢性壓迫性損傷（chronic con‐striction injury，CCI），構建大鼠三叉神經痛動物模型（IoN-CCI）后，探索Sp5C中小膠質細胞激活情況及其隨時間的變化，同時研究該變化與大鼠頜面部的疼痛是否具有一致性，以期為進一步探索三叉神經痛發病機制提供思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗自四川大學動物實驗中心購買8～10周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠，體重230 g±20 g，無疾患。大鼠在室內溫度25℃±2℃的空調房內飼養，食物及水源充足。所有大鼠均符合國際動物實驗要求，在正常晝夜節律下飼養3 d，待適應環境后進入實驗。

本實驗共使用了48只大鼠，隨機抽取8只作為空白對照組，再隨機將剩余40只分為IoN-CCI組及假手術組（各20只），2組中各8只用于行為學觀察、機械痛閾測試及體重測量，至第30天處死取材，其余12只分別在術后第1、5、10、15天處死取材。

1.2 眶下神經部分結扎動物模型的建立

按照體重50 mg·kg-1體重的劑量經由腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，將大鼠仰面固定在手術臺上，使用開口器打開大鼠上下頜，碘伏消毒后，經上腭第二橫皺襞與右側頰黏膜轉折處切開3～5 mm切口，用自制圓頭探針經切口探入，緊貼大鼠上頜骨向眶下緣滑動，向內向上勾拉，可見眶下神經（圖1A）。IoN-CCI組采用5-0絲線結扎眶下神經，松緊以使其略小于該神經的直徑、稍微減緩神經表面的血流通過但不至完全阻滯為宜。兩結之間間隔約2 mm。假手術組稍稍勾拉神經組織，不予結扎。隨后4-0絲線縫合傷口1針。手術過程如圖1所示。

圖1 眶下神經結扎實驗過程Fig 1 Experimental process of infraorbital nerve ligation

1.3 體重變化測量

在相同的環境、采用相同的飼料喂養大鼠。在手術當天（術前）及術后第1、5、10、15、30天測量大鼠體重，以空白對照組作為對比，觀察口內開口對大鼠體重的影響，輔助判斷手術對進食的影響。

1.4 行為學變化觀察

將大鼠放置在下方通氣的透明玻璃盒（26 cm×14 cm×16 cm）中，保證大鼠可以在其內自由活動，待其適應至少5 min后，開始觀察大鼠。每只大鼠觀察10 min，采用計時器計算大鼠搔抓面部（face-grooming）累積時間。搔抓面部時間計入標準為：1）大鼠用前肢觸碰手術側觸須墊及鼻尖部分；2）觸碰頭頂或身體其他部分不計入；3）僅觸碰非手術側不計入。觀察人員預先不知道大鼠分組情況。

1.5 機械痛閾測試

大鼠在進行機械痛閾測試之前5 d適應環境，并在正式測試前3 d進行適應性測驗。機械痛閾通過電子Von Frey測痛儀測量。將大鼠放入塑料錐形限制器（長度25 cm）中，于前開口完整露出頭部及前肢，保證其頭部可以自由擺動（圖2）。待大鼠平靜5 min后，將纖維絲靠近大鼠眶下神經感受區（觸須墊及其附近皮膚），以非常緩慢的速度加力。電腦端顯示出隨力值逐漸增高的坡形曲線，當大鼠出現頭部回縮、偏向對側或用前肢攻擊探針時，加力被動停止，以該曲線的最大力值為痛閾。待大鼠休息3 min后，再次重復上述操作。操作中避免反復戳同一個點造成組織損傷導致測量偏差。每只大鼠進行3次，以最大值為其痛閾。在術前（0 d）和術后第1、5、10、15和30天分別測量IoN-CCI組及假手術組手術同側及對側的痛閾，衡量大鼠痛閾變化。

圖2 電子Von Frey纖維絲測試痛閾Fig 2 Pain threshold detection using electronic Von Frey fila‐ment

1.6 實驗動物取材

將大鼠按照50 mg·kg?1體重的劑量經由腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，待麻醉后開胸，灌注針從心間插入左心室，用止血鉗固定，再用剪刀剪開右心耳，開始灌注生理鹽水，待肝臟變白后繼續灌注4%多聚甲醛。灌注完成后，用剪刀剪開顱頂皮層，暴露顱骨，止血鉗沿枕骨大孔處將顱骨剝開，去除大腦組織，再輕輕地將小腦剝去，暴露延髓組織，將延髓鈍性分離后，切取Sp5C組織（圖3）。

圖3 三叉神經核脊束尾側核取材位置Fig 3 Location of spinal trigeminal nucleus caudal part

1.7 免疫組織化學染色

組織在4%多聚甲醛中固定24～48 h，脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。石蠟標本連續切片（厚5 μm），經脫蠟、水化、抗原修復，冷卻至室溫后行大鼠小膠質細胞標志物鈣離子結合銜接分子1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）抗體（1∶1 000，Cell Signaling Technologie公司，美國）免疫組織化學常規染色。光鏡下觀察Iba-1在Sp5C中的表達和分布情況并拍照。使用Image-J軟件進行定量分析。

1.8 統計分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。數據符合正態分布則采用均數±標準差表示，組別與時間的影響采用重復測量的雙因素方差分析。2組間同時間點比較采用獨立樣本t檢驗，3組以上則采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對差異進行評估，并采用LSD進行事后比較。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體重變化

空白對照組、假手術組、IoN-CCI組大鼠體重隨時間變化見表1。術前及術后第1天3組間體重差異無統計學意義，術后第5天IoN-CCI組體重開始低于空白組，并持續到第30天，差異有統計學意義（均P<0.05）。IoN-CCI組術后第30天的體重為360.50 g±10.06 g，比空白對照組 （381.62 g±8.66 g）低5.51%。

表1 各組大鼠體重變化Tab 1 Changes in body weight of rats of every group g，n=8

2.2 行為學變化

眶下神經部分結扎對大鼠搔抓面部行為的影響見圖4。大鼠搔抓面部時間的變化受術后時間（P<0.01）和組別的影響（P<0.01）。對同時間點的搔抓面部時間進行t檢驗分析，結果顯示，IoNCCI組在術后第1天（P<0.05）、第5天（P<0.01）、第10天 （P<0.01）、第15天 （P<0.05）、第30天（P<0.05）的搔抓面部時間高于假手術組。

圖4 各組大鼠搔抓面部時間的變化Fig 4 Changes in face-grooming time of rats of every group

2.3 機械痛閾變化

IoN-CCI組與假手術組機械痛閾的變化見圖5。按照眶下神經結扎與否、手術同側與對側，總共分為4組，重復測量的雙向方差分析表明，機械痛閾受到組別和手術后時間的影響（P<0.01）。術前及術后第5天，各組間差異均無統計學意義，而術后第1、10、15、30天，IoN-CCI組手術同側痛閾低于假手術組同側（均P<0.05），尤其第10天最為明顯。IoN-CCI組同側、假手術組同側及假手術組對側3組間術后痛閾差異均無統計學意義。

圖5各組大鼠頜面部機械痛閾變化Fig 5 Changes of maxillofacial mechanical pain threshold of rats of every group

2.4 Sp5C中Iba-1表達變化

圖6 示通過免疫組織化學標記Iba-1的染色情況。圖6A可見，與假手術組相比，IoN-CCI組手術側Iba-1表達在術后第5～15天增加且集中分布在Sp5C。圖6B為IoN-CCI組手術同側及對側Iba-1表達比較情況，可見同側Sp5C區小膠質細胞數量增加且明顯激活，對側則呈零星分布且激活不明顯。圖6C為假手術組同側、IoN-CCI組對側、IoN-CCI組同側的小膠質細胞激活情況定量分析。重復測量的雙因素方差分析表明，Iba-1的表達受組別和時間的影響（均P<0.01）。IoN-CCI同側的Iba-1表達水平在術后第1天至術后第15天與自身對側相比差異均有統計學意義（P<0.01），IoN-CCI同側Iba-1表達水平在術后第10天達到峰值，至第30天與假手術組相比差異無統計學意義。

由于小膠質細胞的變化是動態且可循環的，因此根據文獻資料[7-8]將其大致分為3種：1）分支狀：未激活狀態，小膠質細胞胞體卵圓，分出細小分支；2）中間狀：小膠質細胞胞體狹長，分支變少；3）變形蟲樣：激活狀態，基本不可見細小分支，胞體形狀不規則，染色更深。圖6D為各組小膠質細胞形態圖，黑色箭頭示意分支狀，藍色箭頭示意中間狀，紅色箭頭示意變形蟲狀。

圖6 各組小膠質細胞激活情況隨時間的變化Fig 6 Changes in microglia activation over time of every group

圖6E 為各組小膠質細胞構成比分析結果。IoN-CCI 組同側分支狀小膠質細胞占比在術后第5天至第15 天低于同時間點IoN-CCI 組對側（均P<0.01），術后第10天、第15天低于同時間點假手術組同側（均P<0.05），與之對應的是變形蟲樣小膠質細胞占比增加。IoN-CCI組對側從始至終并未觀察到變形蟲樣細胞。IoN-CCI組同側變形蟲樣細胞在術后第5 天至第15 天占比在30%～40%之間，術后第30天未見。

3 討論

三叉神經的三大分支分別為眼神經、上頜神經以及下頜神經，這三條神經的末端分支分別為眶上神經、眶下神經和下牙槽神經[9]。眶下神經是感覺神經，支配口頜面區的感覺功能，其損傷會引起頜面部的疼痛但不會造成功能障礙[10]，且由于解剖學位置的關系，眶下神經結扎更為方便，因此三叉神經痛模型的建立首選對眶下神經進行慢性壓迫損傷[11]。而即便是對相對容易的眶下神經進行結扎，操作仍較為復雜[12]，過程中可能對眼球造成損傷，建模難度較大。近年來研究[13-14]報道了更為簡便的建模方式，但手術切口在眶下神經分布區域，對疼痛的評估造成一定的干擾。經口內開口建立眶下神經慢性壓迫性損傷的大鼠三叉神經痛動物模型在1997 年由Imamura 等[15]提出，由于開口在口內，對大鼠的進食造成影響。本研究通過體重輔助判斷大鼠營養狀況，雖然IoN-CCI組與假手術組、空白對照組有差異，但IoN-CCI組體重自手術后至第30 天均在大鼠體重的正常參考值內[16]，未出現營養不良。

進行眶下神經部分結扎后，本研究以搔抓面部的持續時間作為自發性疼痛的觀察指標，觀察到IoN-CCI 組與假手術組大鼠在術后第1 天搔抓面部持續時間均有升高，但假手術組在術后第5天搔抓面部時間即有下降，第10 天基本回到基線，筆者猜測術后搔抓面部時間的短暫增高可能是由于手術的創傷或者術中對眶下神經輕微的勾拉導致的；而IoN-CCI 組搔抓面部時間在術后持續升高，至第30 天仍高于假手術組。結合大鼠頜面部痛閾變化的檢測發現，進行眶下神經部分結扎后，大鼠結扎側機械痛閾在術后第10 天降至最低，后逐漸升高，且在第10 天后均明顯低于非手術側以及假手術組。而在術后第1 天及第5天，IoN-CCI 組及假手術組的同側痛閾變化趨勢基本一致，均為術后第1 天降低，術后第5 天基本恢復至基線水平，而直到術后第10 天組間出現明顯差異。筆者推測假手術組術后第1天痛閾降低可能是由于手術創傷引起的炎性反應，而手術組同側術后第5天出現短暫的痛閾上升可能因為手術創傷導致的局部神經水腫反應[17]。

小膠質細胞激活情況與行為學變化和機械痛閾的變化基本一致。同時，IoN-CCI組同側小膠質細胞占比也出現了變化：分支狀小膠質細胞占比先降低后回升，變形蟲樣小膠質細胞占比先增高后降低。當神經發生損傷后，受損的神經元及中樞神經系統的疼痛調節通路發生變化，通過大量神經遞質及其他物質的作用，導致神經性疼痛的發生和維持[18]。損傷導致痛覺傳入神經出現明顯的自發性沖動，同時伴隨電壓門控鈉通道mRNA水平增加[19]，降低動作電位閾值，二者的共同作用下，引起異位沖動發生并沿著痛覺傳遞通路到達感覺皮層，引起自發性疼痛[20-21]。同時，受損神經支配區域附近的痛覺傳入纖維中發生異位神經活動，導致脊髓背角內的興奮性氨基酸及神經肽釋放，引起第二級痛覺神經元突觸后變化，誘導神經元過度興奮，導致原本不足以引起疼痛的觸覺刺激均可導致疼痛信號的傳遞，即痛閾降低。同時，神經損傷可導致小膠質細胞激活，激活后的小膠質細胞形態發生變化，且能分泌大量炎癥因子及神經毒性分子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、一氧化氮合酶及活性氧等，通過擴大炎癥反應參與神經病理性疼痛的發展與維持[22]。小膠質細胞的激活參與疼痛發生和維持的同時，小膠質細胞吞噬能力的提升對機體內環境的穩態的維持和修復也有著重要意義。

本研究通過Iba-1 免疫組織化學染色觀察到眶下神經結扎引起大鼠同側Sp5C 中小膠質細胞激活，同時探索到激活水平隨時間的變化趨勢，該趨勢與眶下神經結扎引起的頜面部疼痛變化相似，說明通過眶下神經結扎建立的三叉神經痛動物模型可引起三叉神經核小膠質細胞激活，且頜面部疼痛變化趨勢與小膠質細胞激活具有一致性。

本研究也有一些不足之處。本實驗參考相關文獻報道選擇8～10 周齡大鼠建立IoN-CCI 模型，而臨床上三叉神經痛患者年齡偏大，若采用中年大鼠（約20個月）會更加貼近臨床三叉神經痛的患病人群。同時，本研究缺乏對于小膠質細胞激活機制的研究，后續將會以IoN-CCI 為模型探究Sp5C 中小膠質細胞的激活模式的相關信號通路，期望找到關鍵靶點，為安全有效地治療三叉神經痛提供新的可能。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。