組蛋白去乙酰化酶4在大鼠骨關節炎軟骨退變中的變化趨勢及作用

顧曉東 李鵬翠 李飛

1.山西白求恩醫院骨科，山西 太原 030032 2.山西醫科大學第二醫院，骨與軟組織損傷修復山西省重點實驗室，山西 太原 030001

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是中老年人常見的關節疾病，因關節疼痛和功能障礙，嚴重影響患者的日常生活[1]。關節軟骨退行性變是OA最顯著的病理特征，隨著病變的進展，會繼發出現關節周圍骨質增生，關節畸形，最終導致關節疼痛及功能喪失[2-3]。雖然在不斷地進行研究，但是關節軟骨退變的機制不清楚，目前尚未有有效的方法延緩或者逆轉關節軟骨退變的發生。近年來，有研究發現，OA人群肥大化軟骨細胞在關節軟骨中的占比增高，這種細胞會大量分泌蛋白酶降解基質，最終破壞軟骨，引起嚴重關節功能障礙[4]。

組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)是調控軟骨細胞發生肥大樣表型變化的關鍵酶類，其可以抑制Runx-2的表達，進而抑制軟骨細胞發生肥大樣改變[5-6]。研究表明，OA患者關節軟骨組織HDAC4的含量較正常軟骨組織明顯降低[7]。然而其在OA發生發展過程中的變化趨勢和與關節軟骨損傷程度之間的關系并不清楚。本研究擬通過構建大鼠膝關節OA模型，研究OA發生發展過程中HDAC4及其下游分子Runx-2的變化規律及其與關節軟骨退變的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

54只8周齡雄性SD大鼠，購自山西醫科大學動物部，實驗通過了倫理審查，并且符合相關部門關于實驗動物管理和使用規定。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶及番紅染色劑購自美國Sigma公司；IL-1β購自PeproTech公司；HDAC4一抗購自美國Proteintech公司；Runx-2一抗購自北京博奧森公司；免疫組化試劑購自北京中杉金橋公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉錄、PCR試劑購自日本TAKARA公司；熒光定量PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 軟骨細胞分離培養

出生3 d內的SD大鼠乳鼠，脫頸處死，75%乙醇浸泡消毒。分離乳鼠胸廓組織，PBS清洗3次，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化90 min，更換0.05% Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化3 h，過濾并收集消化液，低速離心10 min，沉淀為軟骨細胞團，PBS漂洗及離心后，用含10%的胎牛血清的培養基吹打混勻，按照105個/cm2接種，37 ℃，5% CO2培養箱培養[8]。

1.4 體外OA模型

第2代軟骨細胞分為實驗組和對照組，細胞生長至60%～70%時，實驗組加入IL-1β，使其在培養液中的濃度為10 ng/mL，對照組加等體積無菌PBS緩沖液，48 h后行Western blot檢測HDAC4和Runx-2的表達。

1.5 Western blot檢測

提取細胞全蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，室溫封閉2 h。添加HDAC4(1∶500)、Runx-2(1∶500)抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜，然后加入稀釋的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。再次用TBST洗膜，超敏ECL顯色并攝取圖像。Image Lab軟件分析條帶灰度值，β-actin為內參，計算蛋白相對表達量。

1.6 實驗動物分組與手術

54只8周齡雄性SD大鼠，隨機分為假手術組(n=27)和前交叉韌帶切斷(ACLT)組(n=27)。手術簡述：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉 (1 mL/100 g)麻醉。右膝消毒后鋪無菌單。切開皮膚，采用髕內切口，切開關節腔，采用11號尖刀片切斷ACL，抽屜試驗陽性代表手術成功。假手術組只切開關節囊。

1.7 動物取材

術后2、4、8周兩組各取9只大鼠過量麻藥安樂處死，取右膝關節，脛骨平臺做番紅固綠及免疫組化檢測，股骨髁軟骨用于RT-qPCR實驗[8]。

1.8 番紅固綠染色及OARSI評分

大鼠脛骨平臺通過4%多聚甲醛常溫固定，10% EDTA脫鈣6周，制備6 μm組織切片。脫蠟至水，蘇木素染色1 min，流水清洗后鹽酸酒精分化15 s，再次清洗2 min。0.05%固綠染色5 min，1%乙酸酸化。蒸餾水清洗后，0.5%番紅O染色2 min。脫水透明，封片。關節軟骨損傷程度采用OARSI評分[9]。

1.9 免疫組織化學染色

制備大鼠脛骨平臺6 μm組織切片，脫蠟至水，3% H2O2使內源性過氧化物酶失活，加入酶消化液行抗原修復，滴加HDAC4(1∶50)、Runx-2(1∶50)抗體，37 ℃孵育120 min；PBS沖洗后加入羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染。

1.10 RT-qPCR檢測

將大鼠股骨髁軟骨用刀片切下，每3只大鼠股骨髁軟骨混合成一份樣本，共3份樣本。TRIzol試劑提取關節軟骨中的總RNA，然后逆轉錄為cDNA。在QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR儀，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ進行兩步法RT-qPCR反應。基因的相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算。引物序列：18SrRNAF: GATGCGGCGGCGTTATT CCC ，R: GTGGTGCCCTTCCGTCAATTCC；HDAC4 F: GGCTTCCTTGTGGTGGTGTTGG ，R: TGTACTCTCCT CGGCATGGTGTC；Runx-2 F: AACAGCAGCAGCAG CAGCAG ，R: GCACGGAGCACAGGAAGTTGG。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 體外OA模型HDAC4和Runx-2的蛋白表達量

Western blot表明，實驗組(IL-1β組)細胞HDAC4的表達量較對照組細胞降低(P<0.05)，而Runx-2的表達量較對照組升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組細胞HDAC4和Runx-2蛋白表達情況Fig.1 Protein expression of HDAC4 and Runx-2 in each group注：和對照組比較，*P<0.05。

2.2 不同時間點大鼠關節軟骨番紅固綠染色及OARSI評分

番紅固綠染色結果表明，前交叉韌帶切斷組脛骨平臺軟骨在2周時可見軟骨表面尚平整，未見明顯關節軟骨破壞，但軟骨表面開始纖維化，軟骨表層番紅著色淺；4周時軟骨表面開始出現裂隙，番紅著色進一步減少，8周時軟骨表層破壞明顯，裂隙延伸到軟骨中層，部分區域軟骨細胞呈簇狀增生，番紅染色明顯減少。各時間點假手術組的軟骨表面完整，番紅著色均勻。OARSI評分結果顯示，與假手術組相比，前交叉韌帶切斷組各時間點評分均升高(P<0.05)。各時間點假手術組評分差異不明顯；前交叉韌帶切斷組評分隨時間延長升高(P<0.05)(圖2)。

圖2 假手術組和前交叉韌帶切斷組不同時間點番紅固綠染色及OARSI評分結果(×100，標尺：100 μm)Fig.2 Safranin O/Fast green staining and OARSI scores at different time points in Sham and anterior cruciate ligament transection group (×100, scale bar: 100 μ m)注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05。

2.3 大鼠關節軟骨HDAC4和Runx-2免疫組織化學染色結果

免疫組化結果顯示，前交叉韌帶切斷組脛骨平臺軟骨HDAC4陽性染色細胞隨著造模時間延長，其數量逐漸降低，而Runx-2陽性染色細胞數隨著造模時間的延長，其數量逐漸增加，各時間點差異明顯(P<0.05)。假手術組作為對照組，雖然HDAC4的表達隨時間推移有所降低，Runx-2的表達隨著造模時間延長有所增加(P<0.05)，但不如前交叉韌帶切斷組明顯(圖3、4)。

圖3 各組不同時間點HDAC4免疫組化染色結果(×200)Fig.3 Immunohistochemical staining of HDAC4 at different time points in each group (×200)注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術組比較，^P<0.05；和4周假手術組比較，%P<0.05。

圖4 各組不同時間點Runx-2免疫組化染色結果(×200)Fig.4 Immunohistochemical staining of Runx-2 at different time points in each group (×200)注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術組比較，^P<0.05；和4周假手術組比較，%P<0.05。

2.4 大鼠關節軟骨HDAC4、Runx-2 mRNA表達量

RT-qPCR結果顯示，在相同時間點內，ACLT組HDAC4的表達較假手術組降低，Runx-2的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。組內比較，ACLT組HDAC4的表達隨時間推移逐漸降低，Runx-2的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。假手術組HDAC4、Runx-2的表達隨時間推移雖有差異，但沒有ACLT組明顯(圖5)。

圖5 各組不同時間點HDAC4和Runx-2 mRNA的表達比較Fig.5 Comparison of HDAC4 and Runx-2 mRNA expression at different time points between each group注：和假手術組比較，*P<0.05；和2周ACLT組比較，#P<0.05；和4周ACLT組比較，&P<0.05；和2周假手術組比較，^P<0.05；和4周假手術組比較，%P<0.05。

3 討論

軟骨細胞是關節軟骨中僅有的細胞種類，其散在分布于關節軟骨基質中，軟骨細胞在維持軟骨的正常合成和降解代謝中十分關鍵[10]。軟骨細胞表型及其功能的改變會破壞軟骨的代謝穩定性，從而破壞軟骨正常的生物力學性能，最終導致關節軟骨損傷。在OA病變軟骨進行性退變破壞過程中，軟骨細胞發生了肥大樣改變。肥大的軟骨細胞表達Runx-2、MMP-13等因子水平升高，導致軟骨破壞[11-12]。其中，Runx-2在調控細胞肥大表型中起關鍵作用[13]。Runx-2可以促進其下游MMP-13、ADAMTS5等軟骨基質降解酶類的表達，破壞軟骨基質，從而促進骨關節炎的進展[14]。在小鼠膝關節不穩定OA模型中，通過條件性敲除軟骨細胞Runx-2基因，其下游MMP-9、13和ADAMTS4、5、7、12的表達降低，從而延緩OA關節軟骨退變。另外，Runx-2對成骨細胞分化起到關鍵作用[15]，因此在OA進程中，Runx-2的變化同樣會影響軟骨下骨的改變。由于關節軟骨與軟骨下骨之間可能存在密切的關系和相互作用，因此，將小鼠軟骨中的Runx2敲除，這種小鼠不但軟骨降解受到抑制，軟骨下骨硬化亦得到好轉[16]。

HDAC4是Runx-2的上游分子，它可以與Runx-2啟動子結合，抑制其轉錄，使其在細胞內的表達下調，從而起到抑制軟骨細胞發生肥大表型改變的作用[8]。提高細胞中HDAC4的表達水平，可起到與Runx-2敲除相同的抑制軟骨細胞肥大化及后續的軟骨內成骨的效果[17]。HDAC4敲基因鼠由于喪失了其抑制Runx-2的作用，促進了軟骨細胞肥大樣改變的進程，從而導致小鼠骨骼提前發生礦化[5]。另外，HDAC4作為去乙酰化酶，具有去乙酰化的酶活性，由于其特殊的核內外定位序列，其具有核質穿梭的能力，可通過其核質穿梭機制，使Runx-2發生去乙酰化，從而加速其降解[18]。

本研究通過體外細胞OA模型及大鼠前交叉韌帶切斷體內OA模型，并在造模的不同時間點選取大鼠處死，通過番紅染色、免疫組化及PCR等實驗方法研究了HDAC4及其下游Runx-2在OA發生發展過程中的變化趨勢以及其對軟骨退變的影響。從而有助于對這兩種軟骨細胞肥大相關關鍵分子在OA中的作用進行深入的了解。本實驗中，體外OA模型條件下，HDAC4的表達降低，而Runx-2的表達升高。大鼠前叉切斷OA模型結果表明，隨著術后時間不斷增加，即骨關節炎軟骨退變程度的不斷加重，HDAC4的表達量持續下降，而Runx-2的表達持續增高。這說明HDAC4的降低和Runx-2的表達升高參與了OA的病理進程，這種變化可能是由于在OA發生發展過程中，HDAC4的表達量不斷降低，其對Runx-2的抑制作用持續減弱，導致軟骨細胞發生肥大樣改變。本研究通過番紅固綠染色評價了OA發生和進展過程中蛋白聚糖丟失和軟骨破壞情況。結果顯示，隨著術后時間的增加，番紅著色逐漸變淺，且從軟骨表面染色淺逐漸過渡到軟骨中深層染色淺，從軟骨表面粗糙、纖維化進展到軟骨裂隙出現，軟骨面皸裂，破壞。這表明隨著軟骨細胞發生肥大樣改變，軟骨正常的代謝平衡遭到破壞，從而導致OA的不斷進展。OARSI是一種半定量評分，定義為OA分級與OA分期相結合的評估，OARSI分數為0～24分，評分越高，代表軟骨損傷越嚴重[9]。在番紅固綠染色的基礎上，本研究對OA進展過程中軟骨損傷的程度進行了評分，研究表明，隨著時間推移，OARSI評分逐漸升高，OA關節軟骨退變在不斷進展。

綜上所述，本研究發現，在OA發生和進展過程中，HDAC4含量的不斷降低，而其下游Runx-2的表達逐漸增加，導致軟骨細胞發生肥大樣改變，軟骨正常的代謝穩定遭到破壞，導致OA關節軟骨退變。本研究的不足之處在于：前交叉韌帶切斷模型是一種關節不穩定模型，并不能完全模擬OA發生和進展的病理過程，后續將探索更好的動物模型來模擬OA的病理進程，更好地闡明OA的發病機制。另外，后續將進行更詳細的細胞實驗來驗證在OA病理進程中，HDAC4對Runx-2的調控作用，為OA的防治提供理論依據。