柔嫩梭菌灌胃的高鹽飲食小鼠血清炎癥因子及糞便腸道菌群、短鏈脂肪酸水平觀察

雷超，劉聰，劉志華

1廣州醫科大學附屬第五醫院前沿醫學交叉研究中心廣東高校生物靶向診治與康復重點實驗室，廣州 510700；2南方醫科大學附屬東莞醫院肛腸科

中國人群平均攝鹽量達12.5 g，顯著高于世界衛生組織推薦（5 g）［1］。高鹽攝入對免疫系統的影響是當前研究的熱點［2］。高鹽攝入與炎癥反應之間的聯系可能是多種疾病持續惡化的重要機制。研究發現，高鹽攝入與腸道菌群失調產生協同作用，可進一步加重免疫紊亂［3］。柔嫩梭菌是寄生于人類腸道的益生菌，可發酵碳水化合物并產生短鏈脂肪酸［4-5］。研究顯示，柔嫩梭菌在多種免疫性疾病中發揮抗炎效應，如支氣管哮喘［5］、炎癥性腸病［6］。本課題組前期研究發現，長期高鹽飲食顯著減少了小鼠腸道菌群中柔嫩梭菌的相對豐度［7］，而柔嫩梭菌對高鹽飲食誘導的免疫紊亂的影響有待進一步探索。2021年1月—5月，本研究觀察了柔嫩梭菌灌胃的高鹽飲食小鼠血清炎癥因子及糞便中腸道菌群、短鏈脂肪酸水平變化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料SPF級雄性C57BL/6小鼠16只，6周齡，體質量19～20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，于（22±2）℃恒溫動物房、每天12 h光照條件下飼養。老鼠高鹽飼料（8%NaCl）購自廣東省醫學實驗動物中心。柔嫩梭菌購自美國模式培養物集存庫（ATCC）菌種保存中心，接種于ATCC1490培養基中，并于含0.1% O2、10% CO2、10% H2和80%N2的厭氧箱中培養。白細胞介素（IL）1B、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 動物分組及處理方法將16只小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組8只。兩組均給予高鹽飼料喂養16周。實驗組同時以柔嫩梭菌菌體懸液（109CFU/mL）2 mL每隔1 d灌胃，對照組以超純水2 mL每隔1 d灌胃。

1.3 血清IL-1B、IL-6、TNF-α檢測采用EUSA法。使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，腹主動脈取血，收集血液于采集管中并置于碎冰上保存，隨后4 000 r/min離心12 min得到血清。將兩組小鼠血清依次加入ELISA檢測用96孔板，分別加入抗小鼠IL-1B、IL-6、TNF-α，避光孵育30 min，PBS清洗。隨后依次加入過氧化物酶標記的生物素化二抗、TMB和TMB終止液。最后用酶標儀測量450 nm處的光密度值，根據標準曲線計算對應樣品濃度。

1.4 糞便腸道菌群檢測采用高通量測序法進行16S rDNA基因V4片段的基因測序。收集兩組小鼠新鮮糞便，置于標準冷凍管，液氮保存。樣本檢測由北京百邁客生物科技有限公司完成。提取糞便樣本細菌總DNA，置于-80℃冰箱凍存。對DNA樣品進行檢測，根據全長引物序列合成帶有Barcode的特異引物，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化，形成測序文庫，質檢合格的文庫用PacBio Sequel進行測 序。PacBio Sequel下 機數據 為bam格式，通過smrtlink分析軟件導出CCS文件，根據Barcode序列識別不同樣品的數據并轉化為fastq格式數據；將PacBio下機數據導出為CCS文件后，使用lima1.7.0軟件，通過barcode對CCS進行識別，得到的Raw-CCS序列數據；使用cutadapt1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除并進行長度過濾，得到不包含引物序列的Clean-CCS序列；使用UCHIME4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective-CC序列；將Effective-CCS用于Feature（OTUs、ASVs）、多樣性分析、差異分析。

1.5 糞便短鏈脂肪酸定量檢測由深圳微科盟科技生物公司完成。將兩組小鼠糞便（約100 mg）解凍并懸浮，加入15%磷酸50μL、125μg/mL的內標（異己酸）溶液100μL、乙醚400μL進行勻漿1 min，然后以12 000 r/min離心10 min。將上清液通過0.22μm無菌過濾器進行過濾。隨后取1μL液體進行GC-MS分析。

1.6 統計學方法采用SPSS25.0統計軟件。計量資料以±s表示，正態分布的計量資料采用t檢驗，非正態分布的計量資料采用非參數檢驗（Mann-WhitneyU檢驗）。P＜0.05為差異有統計學意義。使用QIIME2軟件分析腸道微生物群α多樣性，α多樣性指標包括Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數。通過基于Bray-Curtis異質性的偏最小二乘法進行β多樣性分析。使用Metastats軟件比較兩組細菌相對豐度，P值由非參數檢驗獲得。對P值進行修正，獲取q值，最后根據P值（或q值）篩選出兩組樣品組成差異的物種，默認P≥0.05。采用Metastats軟件的LefSe分析比較兩組細菌在屬種水平的相對豐度，進一步通過線性判別分析（LDA）估計每個組成物種的豐度對差異效應的影響程度，將顯著差異的對數LDA分數設定為4.0，找到豐度差異顯著的物種。

2 結果

2.1 兩組小鼠血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平比較對照組血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平分別為（524.0±55.4）、（159.4±7.2）、（1 875.0±438.0）pg/mL，實驗組分別為（367.0±8.1）、（87.7±1.8）、（333.9±136.0）pg/mL。實驗組血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平低于對照組（P均＜0.05）。

2.2 兩組小鼠糞便腸道菌群比較兩組共檢測出352個操作分類單元（OTU），其中兩組共有243個OTU，兩組間菌群豐度差異較大。對照組獨有的OTU為36個，不受柔嫩梭菌灌胃影響；實驗組獨有的OTU為73個，為受柔嫩梭菌灌胃影響而產生的。兩組的腸道菌群總體分布較為分散。見OSID碼圖1。實驗組Chao1、Simpson指數高于對照組（P均＜0.05）。與對照組相比，實驗組擬桿菌門及變形菌門相對豐度增加，而厚壁菌門及疣微菌門相對豐度減少（P均＜0.05）。見表1、表2。鼠乳桿菌顯著富集于實驗組，而機會致病菌木糖葡萄球菌、遲緩葡萄球菌顯著富集于對照組。見OSID碼圖2。

表1 兩組小鼠糞便腸道菌群α多樣性指標比較（±s）

表1 兩組小鼠糞便腸道菌群α多樣性指標比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實驗組對照組n 8 8 Ace 201.5±10.5 163.3±19.1 Chao1 202.3±10.1*158.7±19.1 Simpson 0.92±0.0*0.75±0.0 Shannon 4.6±0.2 3.2±0.4

表2 兩組小鼠糞便腸道菌群門水平比較（%，±s）

表2 兩組小鼠糞便腸道菌群門水平比較（%，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實驗組對照組n 8 8擬桿菌門34.0±2.0*17.2±3.2厚壁菌門43.9±3.4*54.4±3.5變形菌門5.4±1.5*1.5±0.8疣微菌門6.8±3.2*25.4±4.6其他9.8±3.1*1.4±0.5

2.3 兩組小鼠糞便短鏈脂肪酸水平比較GC-MS分析結果顯示，實驗組小鼠糞便丙酸、丁酸、異戊酸、己酸水平高于對照組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 兩組小鼠糞便短鏈脂肪酸水平比較（μg/mL，±s）

表3 兩組小鼠糞便短鏈脂肪酸水平比較（μg/mL，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實驗組對照組n 8 8乙酸165.10±18.87 160.43±10.67丙酸22.65±2.55*11.15±1.96異丁酸0.96±0.05 0.69±0.16丁酸15.67±2.25*6.48±1.26異戊酸1.20±0.20*0.50±0.10戊酸1.30±0.31 0.71±0.07己酸0.24±0.02*0.16±0.01

3 討論

飲食成分通過調節免疫穩態和腸道菌群組成影響健康，其中高鹽飲食被認為與慢性炎癥反應相關［8-9］。研究表明，高鹽飲食可加重潰瘍性結腸炎和自身免疫性腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病的組織炎癥［3，10］，可能機制是高鹽飲食使巨噬細胞極化為M1表型并升高促炎介質γ干擾素的水平。一項對健康人群參與者的縱向研究發現，高鹽飲食與促炎單核細胞比例存在顯著的相關性［11］。高鹽飲食誘導腸道菌群失調和代謝改變，誘發組織炎癥［3，10］，因而人為補充缺乏的某種共生菌有望達到治療自身免疫疾病的目的，這也是當前研究的熱點。既往研究表明，高鹽飲食可減少小鼠腸道菌群中的柔嫩梭菌相對豐度［7］。柔嫩梭菌是腸道中最具優勢的三種細菌之一，現已發現其可維持腸道菌群穩態、促進免疫系統成熟、減輕炎癥反應［12-13］。本研究發現，補充柔嫩梭菌后，小鼠腸道內該菌的相對豐度無明顯增多，說明通過灌胃方式并不一定能促進柔嫩梭菌在腸道定植，另外也表明腸道菌群的高度復雜性。但高鹽飲食喂養小鼠的血清炎癥因子IL-1B、IL-6、TNF-α水平明顯降低，表明機體免疫反應被抑制，機制尚待進一步研究。

高鹽飲食小鼠的腸道菌群組成與正常鹽飲食喂養的小鼠存在顯著差異，其優勢菌主要為厚壁菌門、毛螺菌科、瘤胃球菌科，而劣勢菌種為擬桿菌門、乳酸菌屬等［14］。本研究發現，兩組小鼠腸道菌群總體分布明顯不同，補充柔嫩梭菌顯著增加了小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度，表明柔嫩梭菌可提升腸道菌群整體的穩定性。在門水平，補充柔嫩梭菌顯著增加了擬桿菌門的相對豐度，并減少了厚壁菌門的相對豐度。厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值增加不僅會影響機體的碳水化合物代謝，還被認為是與炎癥過程相關的重要因素［15］。本研究結果表明，補充柔嫩梭菌能夠改變這一炎癥表型。本研究中，實驗組鼠乳桿菌顯著富集，對照組機會致病菌木糖葡萄球菌、遲緩葡萄球菌顯著富集。鼠乳桿菌作為一種潛在的益生菌，是最常見的乳酸菌株之一［16］，其通過調節T淋巴細胞活性在維持腸道免疫穩態中起著重要作用［17］，在多種自身免疫性疾病中發揮抗炎作用［10，18］。上述結果表明，補充柔嫩梭菌可有效優化高鹽飲食小鼠的腸道菌群構成，減少機會致病菌，增加益生菌相對豐度，從而糾正高鹽飲食引起的腸道菌群相關炎癥表型。

腸道中的短鏈脂肪酸主要包括丙酸、丁酸、己酸等，其含量受到飲食、年齡等因素影響，并在很大程度上受到腸道菌群構成的影響［19］。短鏈脂肪酸是腸道菌群和免疫系統之間交流的媒介。它們產生的信號通過游離脂肪酸受體在免疫細胞中傳遞，進而發揮免疫調節作用［20］。短鏈脂肪酸不僅在腸道內發揮局部作用，還可影響腸道免疫細胞，并通過炎癥小體調節機體免疫反應［21］。本研究發現，實驗組糞便中丙酸、丁酸、己酸水平顯著高于對照組。已有研究發現，服用丙酸、丁酸可降低壞死性小腸結腸炎模型小鼠血清炎癥因子IL-1B、IL-6水平。本研究結果表明，柔嫩梭菌灌胃顯著增加了丁酸等短鏈脂肪酸水平，推測補充柔嫩梭菌可通過調節腸道菌群構成，影響短鏈脂肪酸代謝，從而發揮抗炎效應。