促炎癥消退介質Maresin1對高糖環境下腎小球系膜細胞纖維化的干預作用觀察

唐詩，萬明，高原

成都醫學院第二附屬醫院核工業四一六醫院內分泌科，成都 610051

糖尿病腎病（DN）突出病理表現為腎小球系膜病變，細胞外基質合成增多，最終導致腎小球硬化和間質纖維化［1］。持續高血糖作用會使腎小球內葡萄糖濃度增高，導致DN進展。葡萄糖轉運蛋白1（GluT-1）作為調節葡萄糖進入腎臟細胞的主要載體，可調節葡萄糖濃度并激活下游細胞因子及信號轉導通路［2］。轉化生長因子β1（TGF-β1）與腎小球硬化及腎小管間質纖維化有關［3］。現已證實，持續葡萄糖作用可促使腎小球系膜細胞（MC）中TGF-β1表達升高，TGF-β1通過激活多種細胞內信號通路，導致GluT-1過表達，造成MC對葡萄糖攝取增加，最終導致纖連蛋白（FN）、Ⅳ型膠原等多種細胞外基質成分累積［4-5］。研究表明，氟伐他汀干預可抑制高糖引起的MC中GluT-1過表達、減少TGF-β1的合成，從而抑制細胞外基質積聚，延緩DN進展［6］。Maresin1是促炎癥消退介質中的一種［7-8］，有著強大的抗炎效果［9-10］。有研究發現，Maresin1可通過抑制TGF-β1誘導上皮—間充質轉化，減少FN的合成與表達，從而延緩肺纖維化進展［11］。2021年8月—2022年3月，本研究觀察了Maresin1對高糖環境下小鼠MC纖維化的干預作用，探索Maresin1能否通過抑制腎小球系膜細胞早期纖維化而延緩小鼠DN進展。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料小鼠腎小球系膜細胞株（中國科學院），Maresin1（美國Cayman Chemical公司），TGF-β1、GluT-1、β-actin引物（上海生工生物工程有限公司），瓊脂糖（西班牙Biowest公司），胎牛血清（澳大利亞Bovogen公司）；小鼠FN、Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒（北京誠林生物科技有限公司），總RNA提取試劑盒（北京天根生化公司），逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒（日本Toyobo公司），低糖DMEM培養基（美國Hyclone公司）。

1.2 細胞分組與干預方法體外培養小鼠MC，將細胞分為NC組、OP組、HG組、M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組、M2+NC組。NC組、OP組、M2+NC組培養于含5.6 mmol/L葡萄糖及10%胎牛血清的低糖DMEM培養基中，OP組在培養基中加入24.4 mmol/L的甘露醇，M2+NC組以10 nmol/L的Maresin1預處理30 min。HG組、M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組培養于含30 mmol/L葡萄糖及10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組分別給予1、10、100 nmol/L的Maresin1預處理30 min［12］。各組均置于37℃、5%CO2培養箱中培養。根據前期實驗結果，高糖環境下，MC中TGF-β1、GluT-1 mRNA及FN、Ⅳ型膠原表達于培養48 h達峰值，培養72 h仍保持高表達，故選擇培養48 h后、待細胞生長密度達80%～90%時進行后續檢測。

1.3 細胞中TGF-β1、GluT-1 mRNA檢測采用RTPCR法。取各組細胞，抽提總RNA，逆轉錄為cDNA，分別擴增產物。TGF-β1基因上游引物序列為5'-AGACAGCCACTCAGGCGTAT-3'，下游引物序列為5'-CTGTCCAAACTAAGGCTCGC-3'；GluT-1基 因上游引物序列為5'-AGATGATGCGGGAGAAGAAG-3'，下游引物序列為5'-CACACAGTTGCTCCACATATTG-3'；內參β-actin上游引物序列為5'-ACCTCTATGCCAACACAGTG-3'，下游引物序列為5'-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3'。TGF-β1、GluT-1、β-actin降火溫度分別為59.8、54.0、54.0℃，熱循環30次，具體步驟參照文獻［13］。PCR產物于2%瓊脂糖凝脂電泳，紫外燈下用凝膠成像系統成像。用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，以目的基因與內參灰度值的比值表示目的基因相對表達量。

1.4 細胞上清液中FN、Ⅳ型膠原檢測收集各組上清液，采用ELISA法檢測FN、Ⅳ型膠原，具體步驟參照文獻［14］。根據標準品的濃度及對應的光密度值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品光密度值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.5 統計學方法采用SPSS20.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

HG組細胞中G1uT-1、TGF-β1mRNA表達及上清液FN、Ⅳ型膠原水平高于NC組、OP組、M2+NC組（P均＜0.05）；M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組細胞中G1uT-1、TGF-β1mRNA表達及上清液FN、Ⅳ型膠原水平低于HG組，且M1+HG組、M2+HG組、M3+HG組呈遞減趨勢（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞TGF-β1、GluT-1 mRNA表達及上清液FN、Ⅳ型膠原水平比較（±s）

表1 各組細胞TGF-β1、GluT-1 mRNA表達及上清液FN、Ⅳ型膠原水平比較（±s）

注：與NC組相比，aP＜0.05；與OP組相比，bP＜0.05；與HG組相比，cP＜0.05；與M1+HG組相比，dP＜0.05；與M2+HG組相比，eP＜0.05。

組別NC組OP組HG組M1+HG組M2+HG組M3+HG組M2+NC組GluT-1 mRNA 0.376±0.035 0.380±0.008 0.686±0.017ab 0.501±0.021abc 0.405±0.045abcd 0.397±0.027abcde 0.371±0.021cd TGF-β1 mRNA 0.737±0.035 0.767±0.014 1.355±0.018ab 1.228±0.013abc 0.930±0.066abcd 0.876±0.018abcde 0.687±0.007cd FN 0.345±0.008 0.352±0.010 0.616±0.010ab 0.598±0.004abc 0.412±0.002abcd 0.398±0.002abcde 0.329±0.001cdⅣ型膠原1.245±0.071 1.262±0.011 1.907±0.019ab 1.713±0.104abc 1.478±0.051abcd 1.451±0.034abcde 1.289±0.001cd

3 討論

持續高血糖作用可引起腎小球系膜細胞外基質堆積、成纖維細胞和腎小球纖維蛋白合成增加、腎小球硬化及腎小管間質纖維化，最終導致DN的發生［15］。DN有效治療措施較少，最終只能以腎移植和透析治療維持患者生命［16］，如何有效延緩或抑制DN的發生發展是當前研究的熱點與難點。腎組織纖維化是DN重要的病理生理基礎，若能拮抗腎早期纖維化則可明顯延緩腎臟損傷的進程［17］。

GluT負責將葡萄糖由細胞外擴散至細胞內，對細胞新陳代謝起著重要作用。研究表明，腎臟組織內分布GluT-1～5，MC及其基質內的GluT主要以GluT-1為主，GluT-1可調節MC葡萄糖濃度，并進一步激活下游的細胞因子及信號轉導通路，從而參與DN的進展［18］。研究發現，DN患者腎小球GluT-1表達明顯增高，部分血糖控制良好的患者也有GluT-1過表達［19］。有學者將過表達GluT-1載體轉染血糖正常的小鼠，小鼠最終進展為DN，提示在DN的發生發展中，GluT-1可能還存在獨立于高血糖之外的致病作用［20］。TGF-β1在MC合成及分泌細胞外基質的過程中發揮重要作用。細胞外持續性高糖刺激可作為促纖維化因素作用于MC，促進TGF-β1的合成與分泌；TGF-β1過表達能通過激活蛋白激酶等細胞信號通路因子和多種細胞因子促使細胞外基質沉積，導致糖尿病腎纖維化的發生和發展［21-22］。研究發現，在DN的病程中，GluT-1和TGF-β1可相互作用，形成惡性循環：持續的高糖作用促使TGF-β1表達增加，而升高的TGF-β1可通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路誘導GluT-1過表達［23］，導致腎臟細胞葡萄糖攝取增加和利用方式改變，進而通過蛋白激酶C及多元醇通路促進TGF-β1的表達及活化［24］，導致系膜基質大量代謝產物如FN、Ⅳ型膠原等沉積，最終導致DN惡化。本研究前期實驗發現，高糖作用下小鼠MC中TGF-β1、GluT-1 mRNA表達呈時間依賴性增加，并于48 h達峰值，同時細胞上清液中FN、Ⅳ型膠原水平均升高。但TGF-β1與GluT-1相互作用具體機制及相關信號通路仍需進一步探索。

既往研究表明，阻斷TGF-β1/Smad信號通路或應用內源性抗纖維化蛋白可減輕腎纖維化［25］。在動物實驗研究中，使用TGF-β1中和抗體和TGF-β1信號抑制劑可有效降低FN水平，干預腎纖維化［26］。但介于多種細胞因子對GluT-1具有調節作用，單純使用TGF-β1阻斷劑不能最終影響GluT-1的表達。李英等［6］研究發現，氟伐他汀干預可減少高糖刺激下MC中TGF-β1的合成及GluT-1表達，從而抑制細胞外基質FN及Ⅳ型膠原積聚，延緩DN進展。LUO等［27］發現，芡實可能通過下調腎組織中GluT-1及TGF-β1表達，從而延緩DN進展。

Maresin1是促炎癥消退介質之一，具有強大的抗炎活性［7-8］。大量研究顯示，Maresin1在各種急慢性炎癥中表現出抗炎作用［28-29］。有研究發現，Maresin1還可通過抑制TGF-β1誘導的上皮—間充質轉化，恢復上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白表達，抑制FN和平滑肌肌動蛋白表達，從而延緩肺纖維化進展［11］。有學者以二乙基亞硝胺誘導大鼠肝纖維化，使用Maresin1干預后，大鼠AST、ALT水平趨于正常，肝臟結構得到恢復，炎癥減輕，肝臟壞死區域減小；Maresin1治療后，促纖維化因子TGF-β1及其受體表達降低，類胰島素生長因子表達正常化。這說明Maresin1有作為抗肝纖維化藥物的可能性［30］。在小鼠慢性胰腺炎模型中，Maresin1干預后胰腺損傷和纖維化明顯減輕［31］。但對于Maresin1能否通過抑制腎纖維化而干預DN進展，目前尚不清楚。

本研究以不同濃度Maresin1干預高糖刺激的MC，結果顯示，MC中GluT-1、TGF-β1mRNA表達和FN、Ⅳ型膠原分泌明顯受抑制，且與Maresin1濃度呈正相關，中劑量組即10 nmol/L的Maresin1作用明顯。而低糖培養的細胞使用Maresin1預處理后，纖維化指標無明顯變化，提示Maresin1可能通過減少高糖狀態下MC中TGF-β1及GluT-1表達，抑制FN、Ⅳ型膠原累積，從而減輕腎纖維化。但Maresin1通過何種信號通路作用于TGF-β1及GluT-1尚不清楚，需要進一步研究加以明確。

綜上所述，Maresin1可能具有抑制腎纖維化、延緩DN發生發展的作用，其機制可能與抑制高糖刺激下MC中TGF-β1、GluT-1過表達及減少FN、Ⅳ型膠原生成有關。上述發現為Maresin1治療DN的研究提供了實驗依據。