壯骨方治療肌少—骨質疏松癥的作用機制分析

蔣夢春，胡洲映，李雙蕾，陳文輝，孫煜宇，何嘉麗，李君宇

1廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530001；2湛江市第一中醫醫院內分泌科；3廣西中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科

肌少—骨質疏松癥（SOP）是指患者符合骨質疏松癥（OP）臨床診斷的同時伴有骨骼肌質量、數量和（或）功能下降。SOP后期可并發骨質疏松相關性脆性骨折，嚴重危害老年人健康［1］。在中國老年人群中，男性、女性SOP患病率分別為10.4%和15.1%［2］。SOP的致病機制復雜，體力活動減少、內分泌因素、炎癥因子浸潤、肌肉或骨細胞釋放促分解代謝的物質增多等多種因素都可引起肌肉、骨骼受損［3］。SOP屬于中醫“肉痿”“骨痿”“虛勞”“骨痹”等疾病范疇。《難經·二十四難》云：“骨肉不相親，即肉濡而卻；肉濡而卻……骨先死。”又因“脾主身之肌肉，腎主身之骨髓”，脾腎虧虛，精氣不足以榮骨充肌，則骨傷肌短，骨枯肉軟，肉軟骨死。廣西名中醫李雙蕾教授提出，脾腎不足、瘀血阻絡、骨髓失養是OP的核心病機，并以益腎填精、活血化瘀、通絡止痛為治療總則，精心選藥組成壯骨方。本課題組前期動物實驗研究證實，壯骨方可能通過Ras-Raf-MAPK信號通路促進成骨細胞生成、分化并增強其活性，通過抑制炎癥反應及增加瘦素、胃饑餓素等水平，發揮預防肌肉萎縮和骨量流失的作用［4-6］。2021年6月—2022年4月，本研究運用網絡藥理學及分子對接方法，整合分析壯骨方的有效活性成分及治療SOP的潛在作用靶點，進一步挖掘壯骨方治療SOP的作用機制，為后續研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 壯骨方活性成分及靶點篩選通過檢索TCMSP數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取壯骨方中淫羊藿、枸杞子、黃芪、骨碎補、杜仲、牛膝、山藥、白術、丹參、三七、甘草的活性成分，以口服生物利用度≥30、類藥性≥0.18為條件進行篩選。在TCMSP中Related Targets標簽獲取各活性成分的靶點，并對所有中藥的活性成分、活性成分對應的靶點、活性成分對應的中藥名進行整合。用Cytoscape3.8.0軟件構建“中藥—活性成分—靶點”網絡圖。將檢索獲得的中藥活性成分作用靶點，通過Unipro數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行靶點基因注釋。

1.2 SOP疾病靶點獲取通過GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）獲取SOP的疾病靶點，輸入“osteoporosis”“sarcopenia”“sarco-osteopenia”檢索后得到相關靶點。

1.3 壯骨方活性成分作用于SOP核心靶點篩選利用R軟件，運用內置函數intersect對中藥成分的相關靶點與疾病相關靶點取交集，并使用R軟件包Venn Diagram制作維恩圖，得到壯骨方活性成分可能作用于SOP的潛在靶點。將交集靶點導入到STRING數據庫（https：//string-db.org/），選定“Homo sapiens”物種，將置信度評分設置為＞0.9，并選擇隱藏蛋白質相互作用（PPI）網絡圖中斷開連接的節點，其余參數默認，構建交集靶點相互作用網絡拓撲。利用Cytoscape3.8.0軟件中Cythubba插件計算網絡各節點的拓撲參數（DMNC、Degree、Closeness和Betweeness），以大于這四個拓撲參數中值為篩選條件，得到壯骨方治療SOP的核心靶點。

1.4 核心靶點基因功能分析利用Cytoscape3.8.0軟件的GlueGO插件對核心靶點進行GO分析及KEGG富集分析。設定P＜0.01，采用Bonferroni法進行校正，最小與最大基因富集單位為3、8，Kappa Score默認為0.4。

1.5 核心活性成分與核心靶點的分子對接驗證將篩選出的核心活性成分及核心靶點用于分子對接。從Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載小分子化合物結構，在RCSB PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載相關靶點的蛋白結構，利用Auto Dock軟件作去除水分子、氫等處理，運用AutoDock MGL Tools1.5.6、Pymol2.6、AutoDock Vina1.1.2軟件進行分子對接模擬，獲取對接能量。

2 結果

2.1 壯骨方活性成分和作用靶點篩選結果壯骨方中11味中藥的活性成分共297個，其中淫羊藿21個、枸杞35個、黃芪16個、骨碎補15個、杜仲25個、懷牛膝16個、山藥12個、白術4個、丹參58個、田七7個、甘草88個。利用Cytoscape3.8.0軟件構建“中藥—活性成分—靶點”網絡圖，見OSID碼圖1。對應靶點數量排名前五的活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮Ⅱa、柚皮素，對應靶點分別有108、48、44、29、27個。

2.2 壯骨方活性成分治療SOP的核心靶點篩選結果搜索到SOP疾病靶點4 176個（已去掉重合基因）。將4 176個疾病靶點與297個壯骨方活性成分作用靶點交集，獲得交集靶點173個，見OSID碼圖2。將173個交集靶點導入STRING數據庫建立PPI網絡，見OSID碼圖3。計算出PPI網絡的拓撲參數，分析得出壯骨方治療SOP的核心靶點共16個，見表1。

表1 壯骨方治療SOP核心靶點的網絡拓撲學參數

2.3 核心靶點基因GO分析結果對16個核心靶點進行GO生物過程分析，結果顯示核心靶點基因主要涉及對肌肉拉伸的反應、對組織生長的正向調節作用、細胞對血管內皮生長因子刺激的反應、脂多糖介導的信號通路、蛋白質的入核轉運等生物過程。詳見OSID碼圖4。

2.4 核心靶點基因KEGG富集分析結果KEGG富集分析結果共22條，交集靶點主要涉及糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物—糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路、催乳素（GnRH）信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、Toll樣受體信號（TLR）通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等。詳見OSID碼圖5。

2.5 核心靶點—通路網絡構建情況利用Cytoscape3.8.0軟件的ClueGo插件，列出壯骨方治療SOP核心靶點的代表性富集KEGG途徑。基于表2可看出，壯骨方中核心靶點FOS、RELA、MAPK8、IL-4、ESR1、JUN、TP53、STAT3等可干預低氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、脂肪細胞因子信號通路、胰島素抵抗、TLR信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、GnRH信號通路、2型糖尿病、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路等。

表2 壯骨方治療SOP核心靶點KEGG富集分析結果

2.6 壯骨方核心活性成分與核心靶點的分子對接結果對接完成后，得到化合物與蛋白結合的自由能為負值，一般認為絕對值大于7時，小分子與蛋白結合的可能性較大。由表3可見，壯骨方核心活性成分與核心靶點的結合較好。

表3 壯骨方核心活性成分與核心靶點分子對接的結合能（kJ/mol）

3 討論

年齡增長相關的骨骼肌質量、肌肉強度下降是不可避免的自然過程，是誘發SOP的重要因素。SOP可導致身體平衡力下降，增加跌倒及脆性骨折發生風險，已成為中老年患者死亡、致殘的高危因素之一，因此有效防治SOP意義重大。

壯骨方中淫羊藿溫腎強骨、黃芪健脾益氣，共奏補脾腎、強筋肉、助精髓之效，共為君藥；山藥、枸杞子、白術、甘草可補脾陰、滋腎精，杜仲、骨碎補補腎健骨，懷牛膝益補肝腎，合為臣藥；佐以丹參、田七活血化瘀止痛，全方滋補脾腎、益氣活血并用，補瀉兼施。

本研究通過藥物成分靶點分析，篩選壯骨方治療SOP的關鍵活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮Ⅱa、柚皮素等。槲皮素是一種強有力的抗氧化劑，可促進骨髓間充質干細胞的成骨分化及抗凋亡能力［7］，提高骨骼肌細胞活力以預防肌肉萎縮［8］。丹參酮可抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路上細胞外信號調節激酶的高表達及磷酸化，促進軟骨細胞增殖及抗軟骨損傷［9］。丹參酮還具有類雌激素作用，可增強成骨細胞活性、抑制破骨細胞活性，延緩骨骼肌萎縮及骨量流失［10］。山奈酚通過抑制炎癥反應和脂肪生成，減輕氧化應激，同時抑制成骨細胞凋亡及破骨細胞分化來實現骨骼保護作用［11］。柚皮素具有抑制破骨細胞分化及功能相關的特異性基因表達的作用，可降低去卵巢小鼠的骨轉換速率以提高骨質量［12］。

PPI網絡分析結果顯示，壯骨方治療SOP核心靶點排名靠前的有FOS、RELA、IL-4、ESR1、JUN、TP53、STAT3、MAPK3、MAPK8、MAPK14、AKT1等，我們通過分子對接技術，證實了壯骨方的核心活性成分與核心靶點對接良好，表明上述靶點可能是壯骨方治療SOP的核心靶點。MAPK3、MAPK8、MAPK14都屬于MAPK家族成員。MAPK主要負責細胞外信號的核內傳遞。細胞外刺激激活MAPK信號轉導通路的三級激酶級聯反應，繼而活化C-JUN、c-FOS、STAT3等轉錄因子，促進核內靶基因表達，繼而調節成骨細胞、破骨細胞、肌衛星細胞、血管內皮細胞、免疫細胞等多種細胞的生理病理過程，影響骨骼及肌肉的合成、代謝和損傷修復［13-17］。骨重塑過程依賴于促炎介質和抗炎介質之間的平衡，促炎介質的持續存在可增加骨流失及肌肉萎縮的風險［18］。多項研究表明，FOS、RELA、IL-4、IL-6、STAT3、MAPK參與異常的炎癥和免疫應答過程［19-21］。MAPK14、RELA、STAT3被證實與血管重建及血管內皮生成密切相關，對骨骼微結構（皮質骨及骨小梁）、肌肉組織的生長與再生十分重要［22-24］。AKT1則是多條骨骼、肌肉合成代謝相關信號轉導通路的關鍵參與者之一，缺乏AKT1的小鼠顯示出骨骼缺陷及肌肉再生障礙［25］。

我們通過Clugo分析，得出核心靶點的代表性富集KEGG途徑包括HIF-1信號通路、脂肪細胞因子信號通路、胰島素抵抗、AGE-RAGE信號通路、TLR信號通路、VEGF信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、GnRH信號通路、2型糖尿病、PI3K/AKT信號通路等。這些信號通路在骨骼肌肉系統網絡中會產生交互作用。缺氧時，HIF-1α表達增加，內皮細胞中HIF-1α信號傳導誘導H型血管增生，促進軟骨內血管生成和成骨細胞增殖，使骨量增加［26］。VEGF是重要的血管生成刺激因子，參與外周血源性間充質基質細胞介導的新生血管形成和組織再生［27］。基于VEGF信號通路和血管生成的治療方案可顯著減輕OP患者的疼痛并促進骨骼、肌肉生長。VEGF可調節成骨細胞和破骨細胞活性，異常VEGF信號轉導可引起軟骨變性、骨贅形成、骨硬化癥及過度的炎癥反應［28］。

研究表明，AGEs與肌肉和血管中的RAGEs結合，導致炎癥、血管內皮功能障礙、血管鈣化和骨骼肌血流病理改變，加速動脈粥樣硬化斑塊及血栓的形成，進而導致肌肉減少、肌肉功能減退及骨量流失［29］。PI3K/AKT信號通路在骨代謝及骨骼肌的萎縮、肥大過程中扮演重要角色，上調AKT1表達不僅可以促進萎縮肌肉恢復，還能通過調節骨折端的應力刺激及促進成骨分化，加速骨折愈合［30］。TLR信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路皆為重要的炎癥信號通路，本課題組前期研究結果表明，壯骨方可調節低度慢性炎癥、胰島素抵抗及脂肪代謝［4-5］。

綜上所述，壯骨方活性成分可通過多靶點、多通路干預成骨細胞、破骨細胞及成肌細胞分化，調節骨骼肌代謝合成過程，具有減輕氧化應激、促進血管重建及內皮再生等多種治療作用。本研究運用網絡藥理學方法預測壯骨方治療SOP的作用機制，并進行分子對接試驗驗證，為壯骨方藥理機制相關后續研究提供了依據。然而，中藥復方活性成分與疾病靶點的相互作用機制復雜，尚需更多的基礎研究驗證以上結論。