糖尿病腎病患者血清Wnt5a水平變化及其影響因素分析

闞全娥，趙夢(mèng)宇，袁家楠，曹歡，郭文雨

1河南大學(xué)人民醫(yī)院鄭州大學(xué)人民醫(yī)院河南省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450003；2鄭州市第九人民醫(yī)院內(nèi)分泌科

糖尿病腎?。―KD）是終末期腎臟病的主要原因［1］。DKD早期特征為高血糖引起腎血流動(dòng)力學(xué)變化，腎小球高灌注和高濾過(guò)導(dǎo)致腎小球基底膜和系膜基質(zhì)增加、腎小球體積增大，進(jìn)而發(fā)生功能障礙，尿白蛋白排泄增加，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球肥大、足細(xì)胞損傷、腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，最終發(fā)生DKD［1］。DKD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種因素有關(guān)。炎癥是DKD發(fā)生的重要機(jī)制之一。研究顯示，在DKD的初始階段，腎小球和近端小管中生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子水平增高均可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生［1］。無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員5a（Wnt5a）是巨噬細(xì)胞釋放的強(qiáng)促炎因子，是Wnt家族的重要成員。本研究觀察了DKD患者血清Wnt5a水平變化，分析血清Wnt5a與炎癥因子、血糖、血脂及胰島素抵抗（IR）的關(guān)系，旨在為臨床早期防治DKD探索新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2019年4月—2020年6月在河南省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的DKD患者100例，均符合1999年WHO糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)［3］和2021版中國(guó)糖尿病腎病防治指南中DKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病及特殊類型糖尿??；6個(gè)月內(nèi)發(fā)生糖尿病急性并發(fā)癥、創(chuàng)傷疾病手術(shù)、急性心梗、嚴(yán)重腦血管疾病及肝硬化患者；經(jīng)腎活檢確診的原發(fā)性腎臟疾病、其他繼發(fā)性腎臟疾病及透析患者；合并惡性腫瘤或感染性疾病的患者。根據(jù)尿白蛋白與肌酐比值（UACR），將患者分為微量白蛋白尿組（UACR 30～300 mg/g）和大量白蛋白尿組（UACR＞300 mg/g）各50例。微量白蛋白尿組男25例、女25例，年齡44～71（57.64±6.26）歲，BMI（25.65±1.30）kg/m2，糖尿病病程5～12（8.06±1.60）年，UACR（147.26±48.93）mg/g；大量白蛋白尿組男27例、女23例，年齡48～72（59.56±5.64）歲，BMI（25.73±1.28）kg/m2，糖尿病病程5～15（9.88±2.16）年，UACR（536.09±158.91）mg/g。另選擇UACR＜30 mg/g的2型糖尿?。═2DM）患者50例作為對(duì)照組，其中男26例、女24例，年齡44～74（58.42±6.52）歲，BMI（25.61±1.31）kg/m2，糖尿病病程1～9（5.00±2.02）年，UACR（10.80±4.65）mg/g。三組性別、年齡、BMI比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組病程長(zhǎng)于對(duì)照組、UACR高于對(duì)照組，大量白蛋白尿組UACR高于微量白蛋白尿組（P均＜0.01）。本研究通過(guò)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 血清Wnt5a及炎癥因子檢測(cè)采集患者空腹靜脈血5 mL，離心獲得上層血清，-80℃冰箱保存待測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)血清Wnt5a、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）。Wnt5a試劑盒購(gòu)于中國(guó)武漢華美生物工程有限公司，TGF-β1、IL-6、TNF-α試劑盒購(gòu)于中國(guó)武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 血糖、血脂指標(biāo)檢測(cè)采集患者空腹靜脈血5 mL。采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖（FPG）。采用BIO-RAD D-10高效液相層析法檢測(cè)糖化血紅蛋白（HbA1c）。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定空腹胰島素（FINS），計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。血清Wnt5a的影響因素分析采用多元線性回歸分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清Wnt5a水平比較對(duì)照組、微量白蛋白尿組、大量白蛋白尿組血清Wnt5a水平分別為（0.98±0.24）、（1.24±0.48）、（1.56±0.50）ng/mL。微量白蛋白尿組、大量白蛋白尿組血清Wnt5a水平高于對(duì)照組，大量白蛋白尿組高于微量白蛋白尿組（P均＜0.05）。

2.2 三組血清炎癥因子、血糖、血脂水平及HOMAIR比較與對(duì)照組相比，大量白蛋白尿組、微量白蛋白尿組HbA1c、TC、TGF-β1、IL-6、TNF-α升高，大量白蛋白尿組FPG、HOMA-IR、LDL-C升高（P均＜0.05）；與微量白蛋白尿組相比，大量白蛋白尿組HbA1c、TC、TGF-β1、IL-6、TNF-α升高（P均＜0.05）。見(jiàn)表1、表2。

表1 三組血清炎癥因子水平比較（±s）

表1 三組血清炎癥因子水平比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與微量白蛋白尿組相比，#P＜0.05。

組別微量白蛋白尿組大量白蛋白尿組對(duì)照組n 50 50 50 IL-6（pg/mL）34.90±10.59*45.10±11.99*#8.36±4.83 TGF-β1（ng/mL）4.78±1.80*5.92±1.90*#0.77±0.55 TNF-α（pg/mL）35.16±12.64*45.38±13.21*#7.79±4.62

表2 三組血糖、血脂指標(biāo)及HOMA-IR比較（±s）

表2 三組血糖、血脂指標(biāo)及HOMA-IR比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與微量白蛋白尿組相比，#P＜0.05。

組別微量白蛋白尿組大量白蛋白尿組對(duì)照組n 50 50 50 HbA1c（%）9.84±1.53*10.76±1.52*#8.30±0.98 FPG（mmol/L）9.61±2.63 10.52±1.59*8.64±1.29 TC（mmol/L）4.96±0.83*5.62±1.01*#4.16±0.54 TG（mmol/L）2.13±0.34 2.19±0.60 2.10±0.40 HDL-C（mmol/L）1.13±0.26 1.10±0.14 1.18±0.24 LDL-C（mmol/L）2.41±0.67 2.70±0.74*2.33±0.57 HOMA-IR 5.33±2.77 6.04±2.18*4.14±1.55

2.3 血清Wnt5a與炎癥因子、血糖、血脂、HOMAIR及UACR的相關(guān)性血清Wnt5a與TGF-β1、IL-6、TNF-α、HbA1c、FPG、HOMA-IR、TC、LDL-C、UACR均呈正相關(guān)（r分別為0.575、0.544、0.580、0.691、0.631、0.660、0.541、0.535、0.625，P均＜0.01）。

2.4 血清Wnt5a的影響因素多元逐步線性回歸分析顯示，UACR、HOMA-IR是Wnt5a的獨(dú)立影響因素。見(jiàn)表3。

表3 血清Wnt5a影響因素的多元線性回歸分析結(jié)果

3 討論

DKD是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥，尚缺乏有效的治療方法。有學(xué)者提出，炎癥是DKD重要的病理生理機(jī)制。在DKD的初始階段，腎小球和近端小管中生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的增加都會(huì)誘導(dǎo)炎癥發(fā)生［2］。Wnt5a可通過(guò)激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，加速DKD的發(fā)生［3］。Wnt5a可通過(guò)激活Wnt-Ca2+/PKC信號(hào)通路，活化NF-κB，引起TNF-α、黏附分子、趨化因子等釋放增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮出現(xiàn)炎癥。在Wnt-PCP通路中，Wnt5a與酪氨酸激酶樣孤兒素受體2（ROR2）結(jié)合，促進(jìn)脂肪合成［4］；Wnt5a與Frz5受體結(jié)合，激活巨噬細(xì)胞及脂肪細(xì)胞下游信號(hào)分子JNK1，引起胰島素受體底物1絲氨酸磷酸化，阻斷胰島素信號(hào)通路，導(dǎo)致IR［5-6］。Wnt5a主要通過(guò)參與上述非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，參與腎臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，加速DKD發(fā)生發(fā)展。腎臟纖維化的特征是成纖維細(xì)胞活化、上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞外基質(zhì)積聚，這些都可導(dǎo)致終末期腎病的發(fā)生［7］。本研究結(jié)果顯示，大量白蛋白尿組和微量白蛋白尿組血清Wnt5a水平均高于對(duì)照組，且大量白蛋白尿組高于微量白蛋白尿組，相關(guān)性分析顯示血清Wnt5a與UACR呈正相關(guān)，提示高水平的Wnt5a參與了DKD的發(fā)生發(fā)展。

Wnt5a與Ca2+結(jié)合，一方面激活PKC，活化NF-κB，促進(jìn)TNF-α、趨化因子等釋放，引起血管內(nèi)皮炎癥；另一方面激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，引起局部或全身炎癥反應(yīng)［8］。炎癥刺激可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，參與Wnt5a轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，促進(jìn)Wnt5a表達(dá)［9］。炎癥因子表達(dá)增加與DKD有關(guān)。糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)高血糖環(huán)境，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增多，激活炎癥介質(zhì)，抑制抗氧化機(jī)制，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激，造成腎臟損傷［10］。本研究結(jié)果顯示，大量白蛋白尿組和微量白蛋白尿組血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平均高于對(duì)照組，且大量蛋白尿組高于微量白蛋白尿組，提示炎癥因子在DKD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

研究顯示，TGF-β1在糖尿病患者腎小球組織中表達(dá)增加［11］。TGF-β1可作用于Wnt5a-Ca2+/PKC通路激活NF-κB，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，加劇局部炎癥。因此，TGF-β1水平異常增高可誘導(dǎo)DKD發(fā)生。血清Wnt5a表達(dá)增高，抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)，與TGF-β1產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，可加速糖尿病患者腎臟纖維化進(jìn)程。Wnt5a能以JNK依賴方式促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Wnt5a可上調(diào)巨噬細(xì)胞中IL-6的表達(dá)［12］。因此推測(cè)，在DKD患者中，Wnt5a可促進(jìn)脂肪組織巨噬細(xì)胞釋放IL-6，通過(guò)Wnt-PCP/JNK通路引起IR，產(chǎn)生全身慢性炎癥反應(yīng)；通過(guò)Wnt-Ca2+/CAMKⅡ通路，引起腎組織巨噬細(xì)胞釋放IL-6，誘導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)。TNF-α可誘導(dǎo)腎臟中MCP-1的表達(dá)。有學(xué)者認(rèn)為，DKD患者體循環(huán)中過(guò)量的TNF-α可能上調(diào)腎臟中MCP-1表達(dá)，趨化和激活巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［13］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，T2DM患者特別是DKD患者血清TNF-α水平顯著增加［14］。本研究結(jié)果顯示，血清Wnt5a與TGF-β1、IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)，提示TGF-β1、IL-6、TNF-α共同促進(jìn)了DKD的進(jìn)展。

慢性高血糖激活DAG-PKC信號(hào)通路，提高DKD患者早期腎臟中一氧化氮的利用率，一氧化氮可提高前列腺素E1水平、增加血管緊張素Ⅱ活性、激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增加、內(nèi)皮功能障礙、腎小球高濾過(guò)和蛋白尿。此外，PKC激活后增加活性氧和糖基化終產(chǎn)物產(chǎn)生，引起TGF-β和纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）分泌增多，促使纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原及細(xì)胞外基質(zhì)增加，導(dǎo)致系膜擴(kuò)張和纖維化［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者血清Wnt5a與HbA1c呈正相關(guān)，提示W(wǎng)nt5a與糖尿病患者血糖水平密切相關(guān)［16］。脂質(zhì)沉積會(huì)加速腎小球損傷和腎小管間質(zhì)纖維化，加速DKD病情進(jìn)展［17］。ox-LDL受體膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白表達(dá)水平增加，可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、TGF-β表達(dá)，系膜細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致腎小球纖維化［18］。在Wnt-PCP通路中，Wnt5a與ROR2結(jié)合，拮抗經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪細(xì)胞形成；Wnt5a與Frz5受體結(jié)合后可促進(jìn)脂肪因子形成，從而加速DKD的進(jìn)展。本研究中，大量白蛋白尿組和微量白蛋白尿組的糖尿病病程、HbA1c、TC高于對(duì)照組，大量白蛋白尿組FPG、LDL-C高于對(duì)照組，血清Wnt5a水平與HbA1c、FPG、TC、LDL-C均呈正相關(guān)，與以上研究結(jié)果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大量白蛋白尿組HOMA-IR、Wnt5a水平均高于對(duì)照組，血清Wnt5a水平與UACR、HOMA-IR均呈正相關(guān)?；貧w分析結(jié)果顯示，UACR、HOMA-IR是Wnt5a的獨(dú)立影響因素。Wnt5a可與Fz受體結(jié)合，激活下游信號(hào)分子JKN1而引起IR。過(guò)量的胰島素可激活腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)，提高腎小球基底膜通透性和囊內(nèi)壓，引起腎小球?yàn)V過(guò)增加，同時(shí)上調(diào)TGF-β1表達(dá)，刺激腎小球系膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，系膜和腎小管間質(zhì)重塑，從而加重腎組織損傷。此外，IR可上調(diào)PAI-1基因表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)腎臟纖維化［19］。這提示IR和血清Wnt5a水平升高在DKD發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，DKD患者血清Wnt5a水平較T2DM無(wú)腎臟病患者明顯升高，血清Wnt5a與炎癥因子、血糖、血脂及IR密切相關(guān)。如能通過(guò)多種途徑對(duì)Wnt信號(hào)通路及Wnt5a進(jìn)行調(diào)控，減輕IR及炎癥反應(yīng)對(duì)腎臟的損害，有望為DKD的治療提供新選擇。