卡格列凈對高糖環境下小鼠腎小球系膜細胞的抗炎、抗凋亡作用及其機制

尹一帆，譚睿陟，王麗，劉建

1成都市第三人民醫院西南交通大學附屬醫院腎內科，成都 610014；2西南醫科大學附屬中醫醫院中西醫結合研究中心；3西南醫科大學附屬中醫醫院腎內科

糖尿病腎病（DKD）是糖尿病常見并發癥之一［1］，已成為導致終末期腎臟病的首位病因［2］。研究表明，炎癥是DKD發生發展的關鍵因素［3］。高血糖可觸發和維持多種信號通路激活，且腎小球系膜細胞相較于腎其他固有細胞更易受高糖環境影響［4］。大量臨床試驗表明，鈉—葡萄糖協同轉運蛋白2（SGLT-2）抑制劑具有腎保護作用［5-6］。KDIGO指南和APSN指南均明確推薦SGLT-2抑制劑作為2型糖尿?。═2DM）伴DKD患者的一線用藥［7-8］。SGLT-2抑制劑可減輕腎臟炎癥及纖維化，改善腎血流動力學穩態，減輕氧化應激水平［9］。TGF-β/Smad3信號通路是導致DKD腎臟炎癥及纖維化的經典途徑，其中Smad3被認為是其中的關鍵因子［10］。2020年5月—2021年1月，本研究觀察了SGLT-2抑制劑卡格列凈對高糖環境下小鼠腎小球系膜細胞的抗炎、抗凋亡作用，并基于TGF-β/Smad3信號通路探討作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要材料小鼠腎小球系膜細胞系SV40 MES13購自中國典型培養物保藏中心。DMEM低糖培養基購自HyClone公司，卡格列凈購自MCE公司，葡萄糖購自美國Sigma公司，兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體購自萬類公司，鼠抗鼠Smad3單克隆抗體、HRP標記鼠抗鼠IgG、鼠抗鼠TNF-α單克隆抗體、鼠抗鼠IL-6單克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔抗鼠p-Smad3單克隆抗體、FITC-兔抗鼠IgG購自Cell Signaling Technology公司，HRP標記山羊抗兔IgG購自北京博奧森公司。MCP-1 ELISA試劑盒購自欣博盛公司，TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自睿信生物公司，Annexin V-FIFC/PI試劑盒購自南京諾唯贊公司，轉染試劑購自美國Zata Life公司。

1.2 卡格列凈作用濃度篩選及分組處理將SV40 MES13細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基中；采用CCK8法觀察不同濃度卡格列凈對細胞存活率的影響，篩選出卡格列凈的低劑量干預濃度為5μoml/L，高劑量干預濃度為15μoml/L。將細胞隨機分為正常組、高糖組、卡格列凈1組、卡格列凈2組。正常組在含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培養基中培養，高糖組、卡格列凈1組、卡格列凈2組在含35 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養基中培養，卡格列凈1組、卡格列凈2組分別加入5、15μoml/L的卡格列凈。各組均培養24 h后進行后續檢測。

1.3 細胞培養液上清及細胞中炎癥因子檢測收集各組細胞培養液上清，參照ELISA試劑盒說明書檢測MCP-1、TNF-α、IL-6。收集各組細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton破膜工作液室溫通透15 min；加入10%山羊血清封閉1 h，加入稀釋后的TNF-α一抗、IL-6一抗，4℃過夜；加入稀釋的二抗，室溫避光孵育1 h，加入DAPI工作液，室溫靜置10 min；熒光顯微鏡觀察，用Image J軟件分析各組免疫熒光圖像的平均熒光密度。

1.4 凋亡細胞檢測收集各組細胞，消化離心，參照Annexin V-FIFC/PI試劑盒說明書進行操作，利用流式細胞儀檢測凋亡細胞，在雙色流式細胞儀散點圖上，Annexin V-FIFC陽性、PI陰性為早期凋亡或壞死細胞，Annexin V-FIFC、PI陽性為晚期凋亡細胞或壞死細胞。計算早期凋亡細胞比例和晚期凋亡細胞比例。

1.5 細胞中TGF-β1、p-Samd3、Smad3檢測采用Western blotting法。收集細胞，分別提取各組細胞總蛋白，BCA法測定各組樣品蛋白濃度后變性備用。上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，4℃搖床孵育一抗過夜；洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后用滴加化學發光液顯色并上機檢測。用Image J軟件對圖像灰度值進行分析及處理，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.6 過表達Smad3對卡格列凈作用下高糖SV40 MES13細胞炎癥因子表達及凋亡的影響觀察將SV40 MES13細胞接種于6孔板中培養24 h，分為NC組、HG組、HG+Can組、HG+Can+Smad3 OE組。NC組在含5.5 mmol/L葡萄糖的低糖培養基中培養；HG組、HG+Can組、HG+Can+Smad3 OE組在含35 mmol/L葡萄糖的高糖培養基中培養，HG+Can組加入15μoml/L卡格列凈，HG+Can+Smad3 OE組轉染pcDNA3.1-Smad3質粒24 h后加入15μoml/L卡格列凈。培養24 h后收集細胞，采用Western blotting法檢測TGF-β1、p-Samd3、Smad3，方法同“1.5”；采用免疫熒光法檢測各組細胞中的TNF-α、IL-6，方法同“1.3”；采用流式細胞儀檢測凋亡細胞，方法同“1.4”。

1.7 統計學方法采用GraphPad Prism軟件進行統計分析。計量資料以±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卡格列凈對高糖環境下SV40 MES13細胞的抗炎、抗凋亡作用

2.1.1 各組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平比較高糖組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平低于高糖組，卡格列凈2組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平低于卡格列凈1組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組細胞上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05；與卡格列凈1組相比，△P＜0.05。

組別卡格列凈1組卡格列凈2組高糖組正常組MCP-1 8 588.13±347.20#5 848.40±137.24#△18 207.20±769.58*8 341.93±573.04 TNF-α 390.01±22.55#290.73±11.37#△431.88±24.95*154.28±8.53 IL-6 89.90±3.00#79.03±0.94#△112.68±1.94*81.53±3.31

2.1.2 各組細胞TNF-α、IL-6表達比較高糖組細胞中TNF-α、IL-6表達高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組TNF-α、IL-6表達低于高糖組，卡格列凈2組細胞中TNF-α、IL-6表達低于卡格列凈1組（P均＜0.05）。見表2、圖1。

表2 各組細胞中TNF-α、IL-6表達比較（±s）

表2 各組細胞中TNF-α、IL-6表達比較（±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05，與卡格列凈1組相比，△P＜0.05。

組別卡格列凈1組卡格列凈2組高糖組正常組TNF-α 10.56±0.80#7.20±0.30#△20.12±0.68*5.66±1.05 IL-6 23.60±0.99#16.85±0.70#△37.52±0.89*9.89±0.25

圖1 卡格列凈1組、卡格列凈2組、高糖組、正常組細胞TNF-α、IL-6表達情況（免疫熒光法）

2.1.3 各組細胞凋亡情況比較高糖組早、晚期凋亡細胞比例高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組早期凋亡細胞比例低于高糖組，卡格列凈2組早期凋亡細胞比例低于卡格列凈1組（P均＜0.05）。見表3。

2.1.4 各組細胞TGF-β1、p-Samd3/Smad3表達比較高糖組TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3低于高糖組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞凋亡情況、TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3比較（±s）

表3 各組細胞凋亡情況、TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3比較（±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05，與卡格列凈1組相比，△P＜0.05。

組別卡格列凈1組卡格列凈2組高糖組正常組早期凋亡細胞比例（%）9.47±1.52#5.80±0.56#△13.84±1.08*4.55±0.35晚期凋亡細胞比例（%）7.36±2.93 3.41±0.78 9.71±5.08*2.45±0.93 TGF-β1 0.95±0.48#0.59±0.23#1.71±0.36*0.92±0.34 p-Smad3/Smad3 0.81±0.32#0.48±0.05#1.60±0.41*0.75±0.31

2.2 過表達Smad3對卡格列凈作用下高糖SV40 MES13細胞炎癥因子表達及凋亡的影響

2.2.1 各組細胞TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3比較NC組、HG組、HG+Can組、HG+Can+Smad3 OE組TGF-β1相對表達量分別為0.66±0.09、1.07±0.02、0.84±0.03、1.00±0.08，p-Smad3/Smad3分別為0.30±0.01、1.00±0.01、0.83±0.03、0.91±0.02。HG組TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3高于NC組，HG+Can組TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3低于HG組，HG+Can+Smad3 OE組TGF-β1表 達 及p-Smad3/Smad3高于HG+Can組（P均＜0.05）。

2.2.2 各組細胞炎癥因子表達比較HG組TNFα、IL-6表達高于NC組，HG+Can組TNF-α、IL-6表達低于HG組，HG+Can+Smad3 OE組TNF-α表達高于HG+Can組（P均＜0.05）。見表4。

2.2.3 各組細胞凋亡情況比較HG組早、晚期凋亡細胞比例高于NC組，HG+Can組早、晚期凋亡細胞比例低于HG組，HG+Can+Smad3 OE組早、晚期凋亡細胞比例高于HG+Can組（P均＜0.05）。見表4。

表4 過表達Smad3對卡格列凈作用下高糖環境SV40 MES13細胞TNF-α、IL-6表達及凋亡的影響（±s）

表4 過表達Smad3對卡格列凈作用下高糖環境SV40 MES13細胞TNF-α、IL-6表達及凋亡的影響（±s）

注：與NC組相比，*P＜0.05；與HG組相比，#P＜0.05；與HG+Can組相比，△P＜0.05。

組別HG+Can+Smad3 OE組HG+Can組HG組NC組TNF-α 49.37±5.37△43.70±0.88#60.96±1.58*37.12±0.75 IL-6 51.20±2.06 47.33±2.63#63.56±2.35*47.97±5.18早期凋亡細胞比例（%）6.46±0.46△2.62±0.13#8.30±0.42*0.69±0.16晚期凋亡細胞比例（%）4.96±0.58△2.16±0.15#6.97±0.34*0.46±0.06

3 討論

據報道，30%～50%的T2DM患者會發展為DKD，尋找有效防治DKD的方法一直是目前研究的熱點［11］。SGLT-2抑制劑是一種新型的口服降糖藥，大量臨床研究已證實其具有腎保護作用，但具體機制仍不明確［12］。

高血糖可引起腎小球基底膜增厚、系膜擴張、系膜細胞增生肥大等，最終導致腎小球彌漫性硬化［13］。上述病理改變提示，在糖尿病腎損傷中，對腎小球系膜細胞進行干預可能是防治DKD的有效策略。

持續的高糖環境能誘發炎癥，而炎癥能直接破壞腎臟結構，形成惡性循環，造成不可逆的腎損傷。炎癥因子種類繁多，如趨化因子、促炎細胞因子和黏附因子等［14］。本研究選取MCP-1、IL-6、TNF-α觀察高糖環境對腎小球系膜細胞分泌炎癥因子的影響，結果顯示，高糖環境下，腎小球系膜細胞合成分泌MCP-1、TNF-α、IL-6明顯增加，并促進了細胞凋亡，證實高糖環境介導腎小球系膜細胞炎癥反應的同時加速細胞凋亡。

TGF-β被認為是DKD的重要致病因子［15］，其中TGF-β1是導致腎損傷最重要的細胞因子［16］。TGF-β1可激活下游Smad3，誘導分泌各種炎癥因子、促纖維化因子，從而介導腎臟炎癥、纖維化的發生發展。TGF-β/Smad3信號通路被認為是系膜細胞激活的主要通路［17］。湯夏蓮等［18］研究發現，高糖可引起系膜細胞缺失和凋亡，并上調TGF-β1的表達。ZHANG等［19］研究表明，在DKD模型中調控TGF-β/Smad3信號通路可介導MCP-1的表達。本研究發現，高糖環境下，SV40 MES13細胞中TGF-β1及p-Smad3/Smad3蛋白表達水平明顯增加，說明TGF-β/Smad3信號通路可能在高糖介導的腎小球系膜細胞損傷中發揮一定作用。

SGLT-2抑制劑通過選擇性抑制SGLT-2對葡萄糖和鈉的重吸收，促進尿糖、尿鈉排泄，并降低腎小球高濾過狀態，從而達到降糖目的，還具有抗炎、抗氧化等作用［20-21］。SGLT-2抑制劑可用于DKD患者，其抗炎作用也被越來越多的研究所證實。TERAMI等［22］發現，對db/db小鼠進行12周的達格列凈治療后，可改善腎小球系膜擴張并減少小鼠腎臟中巨噬細胞浸潤；另外，體外實驗還證實，達格列凈可抑制高糖環境下腎小管上皮細胞氧化應激、細胞凋亡及MCP-1、TGF-β等表達。ALI等［23］研究表明，卡格列凈在腺嘌呤誘導的大鼠CKD模型中具有抗炎、抗氧化作用。VALLON等［24］通過糖尿病小鼠模型實驗，發現恩格列凈可介導NF-κB通路抑制其下游CCL2、IL-6等表達。有學者發現，6種不同的SGLT-2抑制劑治療糖尿病小鼠均可降低體內IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α水平［25］。本研究發現，卡格列凈可減少高糖環境下SV40 MES13細胞炎癥因子分泌及細胞凋亡，進一步實驗結果顯示，過表達Smad3可使卡格列凈作用下的高糖SV40 MES13細胞p-Smad3/Smad3、TGF-β1、TNF-α表達增高并促進細胞凋亡，卡格列凈可抑制TGF-β/Smad3信號通路激活。由此推測，卡格列凈抑制高糖環境下腎小球系膜細胞炎癥因子分泌及細胞凋亡的機制可能與抑制TGF-β/Smad3信號通路有關。上述研究結果為卡格列凈治療DKD的機制研究提供了新的理論基礎。