經(jīng)典名方真武湯的物質(zhì)基準(zhǔn)關(guān)鍵質(zhì)量屬性△

尚炳嫻，趙振霞，董慧玲，張佟，蘇建，劉永利*，徐冰*，雷海民

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102400；

2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050200

真武湯首見(jiàn)于漢代張仲景所著的《傷寒論》[1]，由茯苓、白芍、生姜、白術(shù)和附子5 味中藥組成，具有溫陽(yáng)利水的功效。現(xiàn)代臨床上真武湯主要用于治療慢性腎炎、腎病綜合征、尿毒癥及腎積水等陽(yáng)虛水飲內(nèi)停證，真武湯系統(tǒng)疾病[2-5]。該方作為治療太陽(yáng)病及少陰病的經(jīng)典名方，被《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《目錄》）[6]收載。

經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)是指以古代醫(yī)籍中記載的經(jīng)典名方制備方法為依據(jù)制備的中藥藥用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，除成型工藝外，其余制備方法應(yīng)當(dāng)與古代醫(yī)籍記載基本一致[7]。經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)既是保證經(jīng)典名方現(xiàn)代制劑與中醫(yī)傳統(tǒng)臨床所用藥物一致的參照物，又是現(xiàn)代制劑工藝篩選及標(biāo)準(zhǔn)制訂的依據(jù)和準(zhǔn)繩[8-11]。物質(zhì)基準(zhǔn)在經(jīng)典名方研發(fā)過(guò)程中起到承上啟下的作用，是鏈接中醫(yī)臨床傳統(tǒng)用藥形式和現(xiàn)代成品復(fù)方制劑的橋梁，是保證臨床療效不降低、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定一致的核心環(huán)節(jié)[12-15]。

《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見(jiàn)稿）》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《意見(jiàn)稿》）[7]指出，應(yīng)開(kāi)展藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)煎液及物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量研究，確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性，實(shí)現(xiàn)全過(guò)程質(zhì)量控制，通過(guò)物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉出粉率、含量測(cè)定、指紋圖譜或特征圖譜等，確保標(biāo)準(zhǔn)煎液及物質(zhì)基準(zhǔn)的批間質(zhì)量基本一致及可追溯。本研究采用隨機(jī)數(shù)表法將真武湯5味飲片隨機(jī)組合成15批真武湯組方，并相應(yīng)地制備15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，采用高效液相色譜法（HPLC）建立真武湯特征圖譜和指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法，分析飲片與物質(zhì)基準(zhǔn)間的指標(biāo)成分量值傳遞規(guī)律，初步制定真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制，為經(jīng)典名方真武湯及其相關(guān)制劑的研發(fā)及生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo 公司）；1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Pilot5-8M 型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)有限責(zé)任公司)；KQ5200DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；4L 陶瓷鍋（潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司）；H22-X1 型電陶爐（九陽(yáng)股份有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品芍藥苷（批號(hào)：110736-202044，純度：96.8%）、6-姜辣素（批號(hào)：111833-202007，純度：99.3%）、沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-200302，純度：91.5%）、8-姜酚（批號(hào)：111993-201601，純度：93.8%）、(+)-兒茶素（批號(hào)：877-200001，純度：95.1%）、5-羥甲基糠醛（批號(hào)：111626-201912，純度：99.2%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品苯甲酰芍藥苷（批號(hào)：O11GB163260，純度≥98%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

真武湯所需藥材購(gòu)自安國(guó)聚藥堂有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定，符合《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2020 年版規(guī)定，由北京春風(fēng)藥業(yè)有限公司按前期研究確定的炮制方法炮制加工成各批次飲片，并按《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定檢測(cè)，均符合規(guī)定。

根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將真武湯中的5 味飲片進(jìn)行隨機(jī)組合及排序，組成15批真武湯組方物質(zhì)基準(zhǔn)（表1）。

表1 15批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 15批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備

分別稱(chēng)取茯苓41.4 g、白芍41.4 g、生姜41.4 g、白術(shù)27.6 g、炮附子10.0 g，加水1600 mL，浸泡30 min，閉蓋，武火（1500 W）煎煮至沸騰，開(kāi)蓋，轉(zhuǎn)文火（600 W）煎煮保持微沸，約60 min，趁熱以雙層200目濾布濾過(guò)并榨干藥渣，放冷，定容至600 mL，預(yù)凍，真空冷凍干燥（＜-40 ℃，＜20 Pa）72 h，即得。

2.2 真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 WatersC18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，3%A；7～16 min，3%～10%A；16～31 min，10%～13%A；31～37 min，13%～20%A；37～62 min，20%～32%A；62～81 min，32%～46%A；81～86 min，46%～65%A；86～98 min，65%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉0.1 g，精密加入50%甲醇25 mL，超聲處理30 min，6000 r·min-1離心5 min（離心半徑為8.4 cm），用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品芍藥苷、6-姜辣素、沒(méi)食子酸4.978、5.092、10.072 mg，分別加甲醇定容至10 mL；分別精密稱(chēng)取對(duì)照品苯甲酰芍藥苷、8-姜酚、(+)-兒茶素、5-羥甲基糠醛5.261、170.920、5.208、6.571 mg，分別加甲醇定容至25 mL制成相應(yīng)的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密吸取8-姜酚對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，芍藥苷、6-姜辣素、沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL，苯甲酰芍藥苷、(+)-兒茶素、5-羥甲基糠醛對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 mL，混勻后定容至25 mL，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 單味藥供試品溶液的制備 分別取處方用量的茯苓、白芍、生姜、白術(shù)、炮附子飲片，按2.1項(xiàng)下方法制備單味藥物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉；并按2.2.2項(xiàng)下方法制備單味藥供試品溶液。

2.2.5 方法學(xué)考察 精密度：取同一供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以5 號(hào)峰（芍藥苷）為參照峰，計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積及其RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 真武湯特征圖譜方法學(xué)考察 %

穩(wěn)定性：取同一供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。以5 號(hào)峰（芍藥苷）為參照峰，計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積及其RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

重復(fù)性：分別精密稱(chēng)取同一批次物質(zhì)基準(zhǔn)粉末0.05、0.10、0.15 g 各3 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)行HPLC 分析，記錄色譜圖。以5號(hào)峰（芍藥苷）為參照峰，計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積及其RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.6 15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜相似度評(píng)價(jià) 按2.2.1 項(xiàng)下特征圖譜色譜條件分別稱(chēng)取15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)0.1 g，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)行HPLC 測(cè)定，得到15 批真武湯特征圖譜。將15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），以S1 為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜并計(jì)算相似度，15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的相似度均大于0.99。確定了11 個(gè)特征峰，15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜疊加圖見(jiàn)圖1。

圖1 15批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜

2.2.7 真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜共有峰的指認(rèn)及歸屬 將真武湯特征圖譜與混合對(duì)照品溶液及單味藥供試品溶液進(jìn)行對(duì)照，指認(rèn)出其中7個(gè)色譜峰，分別為沒(méi)食子酸（1號(hào)峰）、5-羥甲基糠醛（2號(hào)峰）、(+)-兒茶素（3號(hào)峰）、芍藥苷（5號(hào)峰）、苯甲酰芍藥苷（9號(hào)峰）、6-姜辣素（10號(hào)峰）、8-姜酚（11號(hào)峰），見(jiàn)圖2。其中1號(hào)峰、3號(hào)峰、5號(hào)峰、9號(hào)峰來(lái)自白芍；2號(hào)峰來(lái)自炮附子；10號(hào)峰、11號(hào)峰來(lái)自生姜。綜合15批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果（表3），確定了真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)，供試品特征圖譜中共有11個(gè)特征峰，以5號(hào)峰芍藥苷為參照峰（S峰），計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間偏差應(yīng)在規(guī)定值的±10%之內(nèi)。規(guī)定值為0.274（峰1）、0.331（峰2）、0.695（峰3）、0.908（峰4）、1.164（峰6）、1.208（峰7）、1.240（峰8）、1.707（峰9）、2.190（峰10）、2.452（峰11）。

表3 15批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征峰相對(duì)保留時(shí)間

圖2 真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液及對(duì)照品溶液特征圖譜

2.3 含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，15%～17%A；5～15 min，17%～19%A；15～25 min，19%～55%A；25～28 min，55%～62%A；28～40 min，62%～90%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉0.1 g，加入50%甲醇25 mL，超聲處理30 min，6000 r·min-1離心5 min（離心半徑為8.4 cm），用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 分別取對(duì)照品芍藥苷、6-姜辣素5.772、3.281 mg，分別加甲醇定容至10 mL，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密吸取上述2 個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液4 mL，混合，用甲醇定容至25 mL，分別制成質(zhì)量濃度為0.089 4、0.052 1 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3.4 方法學(xué)考察 專(zhuān)屬性：按2.1 項(xiàng)下方法分別制備不含白芍和生姜的陰性物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，并按2.3.2 項(xiàng)下方法分別制備缺白芍、缺生姜的陰性樣品溶液；取混合對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 白芍、生姜專(zhuān)屬性考察HPLC圖

線(xiàn)性關(guān)系：分別取芍藥苷和6-姜辣素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，1∶1 混合配制成混合對(duì)照品溶液，分別稀釋至1、2、4、8、16、32 倍，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，考察峰面積與質(zhì)量濃度的線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表4。

精密度：取同一供試品溶液進(jìn)行HPLC 分析，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別測(cè)定芍藥苷和6-姜辣素的峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。

穩(wěn)定性：取同一供試品溶液進(jìn)行HPLC分析，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷和6-姜辣素的峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。

重復(fù)性：分別精密稱(chēng)取同一批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)粉末0.05、0.10、0.15 g各3份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，測(cè)定芍藥苷和6-姜辣素的含量，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱(chēng)取與重復(fù)性同一批次物質(zhì)基準(zhǔn)粉末0.05 g 9份，分別按已知芍藥苷和6-姜辣素含量的1.0∶0.5、1∶1、1.0∶1.5 精密稱(chēng)取芍藥苷和6-姜辣素對(duì)照品，按2.3.3項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液；以對(duì)照品溶液為提取溶劑，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3 份；并按2.3.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)行HPLC 分析，測(cè)定芍藥苷和6-姜辣素的含量，計(jì)算其加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 芍藥苷和6-姜辣素含量測(cè)定方法學(xué)考察 %

2.3.5 15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞分析 取15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，按2.3.2 項(xiàng)下方法分別制備15 批真武湯供試品溶液，每批平行2 份；按2.3.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)行HPLC 分析，計(jì)算芍藥苷和6-姜辣素的含量，并計(jì)算飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞，結(jié)果見(jiàn)表5。

根據(jù)上述含量測(cè)定結(jié)果可知，15 批真武湯出粉率為3.21%～4.57%；15 批物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.01～25.35 mg·g-1，飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)轉(zhuǎn)移率為49.77%～61.84%；6-姜辣素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.65～2.57 mg·g-1，飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)轉(zhuǎn)移率為30.11%～58.96%。參照《意見(jiàn)稿》規(guī)定，指標(biāo)性成分含量范圍一般不超過(guò)均值的70%～130%[7]，根據(jù)表5 可知，15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥苷和6-姜辣素含量穩(wěn)定在均值的70%～130%。

表5 15批真武湯出粉率及物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分量值傳遞

3 討論

3.1 物質(zhì)基準(zhǔn)制備方法的考察

本研究采用加10 倍量水閉蓋武火煎煮至沸騰，開(kāi)蓋轉(zhuǎn)文火煎煮保持微沸至煎煮終點(diǎn)的方式制備真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)水煎液，所得濾液經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到凍干粉，作為物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物。在煎煮過(guò)程中分別以微沸30、45、60、75 min 為煎煮終點(diǎn)，第3 份煎煮完后（微沸60 min）的藥渣再加8 倍量水煎煮40 min，得到二次煎液；共制得5份不同煎煮時(shí)間的煎液。以所得水煎液體積為主要依據(jù)，對(duì)煎煮時(shí)間進(jìn)行考察。結(jié)果表明，以微沸45 min 為煎煮終點(diǎn)所得煎液體積與真武湯原文記載最為接近。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

本研究考察25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇3種提取溶劑，結(jié)果顯示，50%甲醇提取的真武湯供試品溶液中各指標(biāo)成分含量最高；分別考察0.05、0.10、0.15 g 3 種凍干粉取樣量，結(jié)果顯示，在0.05～0.15 g 指標(biāo)成分含量與取樣量成正比；考察20、25、50 mL 3 種提取溶劑用量，結(jié)果顯示，25 mL 提取溶劑提取的真武湯供試品溶液中各指標(biāo)成分含量最高；考察回流提取（150 ℃）、超聲提取（200 W，40 kHz）2 種提取方式，結(jié)果顯示，2 種方式提取后的真武湯供試品溶液中各指標(biāo)成分相差不大，且超聲提取的樣品重復(fù)性更好；考察20、30、40 min 3 種提取時(shí)間，結(jié)果顯示，提取30 min的真武湯供試品溶液中各指標(biāo)成分含量最高。故選擇取樣量為0.10 g，以25 mL 50%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min制備供試品溶液。

4 結(jié)論

本研究使用不同批次飲片制備15批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)，建立了真武湯HPLC特征圖譜，共確定了11個(gè)特征峰，指認(rèn)出沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、(+)-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、6-姜辣素、8-姜酚7個(gè)色譜峰，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2008 版）進(jìn)行相似度分析，相似度均大于0.99；以芍藥苷、6-姜辣素為指標(biāo)性成分建立真武湯中多成分HPLC 含量測(cè)定方法，以不超過(guò)質(zhì)量均值的70%～130%為界限設(shè)定各含量指標(biāo)的量值范圍，結(jié)果表明，15 批真武湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.01～25.35 mg·g-1，6-姜辣素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.65～2.57 mg·g-1。