半夏軟腐病生防菌株篩選和田間應用探究△

桂穎，蔣春號，程旭，2，王超，3，周冬梅，4，王沫，鄭穎，郭堅華*，牛冬冬*

1.南京農業大學，江蘇 南京 210095；

2.襄陽市農業科學院，湖北 襄陽 441057；

3.南京國環有機產品認證中心，江蘇 南京 210042；

4.江蘇省農業科學院，江蘇 南京 210014；

5.華中農業大學，湖北 武漢 430070

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Brei 為天南星科（Araceae）半夏屬（Pinellia）多年生單子葉草本植物，是我國重要中藥材之一[1-2]。其在我國廣泛分布于除內蒙古、新疆、青海、西藏以外的地區，主產于四川、湖北、河南、貴州、安徽、江蘇等地。半夏塊莖經炮制可入藥，性溫，味辛，具有降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結的功效[3]。其有種子繁殖、塊莖繁殖和珠芽繁殖3 種繁殖方式。但半夏的有性繁殖退化，結實率和種子的萌發率極低，在自然中以無性繁殖為主。塊莖的收獲源于上一生長季節中已存在的個體，不增加新的個體數，而生產實際中需種量大，因此，著生于葉腋、花序軸等位置繁殖系數大的珠芽成為半夏的主要繁殖器官[4-5]。

半夏具有很好的藥效和商業開發價值，也是重要的出口產品。近年來，國內銷量及出口量成倍增加，而野生資源及產量卻不斷減少，從而使供求缺口日益擴大。其人工栽培日益興盛，使半夏生產中病蟲害愈發嚴重。半夏軟腐病是半夏生長過程中主要病害之一，在全國各種植地均有發生。7月下旬至8月上旬高溫多雨，是半夏軟腐病高發時期，通常使用多菌靈、百菌清、甲基硫菌靈、毒克星等化學農藥進行防治。隨著化學農藥的濫用，抗藥性、環境污染、土壤板結等問題已經愈發嚴重。在國家倡導建設生態農業、走可持續發展道路的形勢下，有必要尋找安全且能保障產量的半夏綠色種植方法。據中國農藥信息網（http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml）數據顯示，我國國內登記用于防治軟腐病的產品共18 種，其中生物農藥有4 種，均為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis制劑，主要防治對象為大白菜。因此，軟腐病的生物防治技術仍有極大的發展空間，尤其是中藥材生防產品的研發。

本研究從田間取樣的感病半夏中分離純化病原菌，按照科赫氏法則進行了診斷鑒定。針對此病菌，從本課題組生防菌種質資源庫中篩選出三菌合劑BBS；開展進一步田間試驗證明BBS 對半夏的促生作用及對細菌性軟腐病的防治效果，并且提高了珠芽分化率、增加了繁殖體數量、促進了光合作用和光合產物的積累，從而達到提高產量的效果。

1 材料

1.1 樣品

本研究所用中藥材樣品由華中農業大學植物科學技術學院王沫教授鑒定為天南星科多年生草本植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Brei 的塊莖。本研究所用生防菌株為蠟質芽孢桿菌Bacillus cereusAR156、枯草芽孢桿菌B.subtilisSM21、沙雷氏菌Serratiasp.XY21 等，均由南京農業大學生物農藥及綠色植保實驗室前期從不同作物生境分離純化并保存。

1.2 儀器

YP-3002 型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；PHS-3E 型pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；SPX-2508SH-Ⅱ型生化培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；ZQLY-180N 型振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）；BioMate 3S 型紫外分光光度計、MicroCL17 型離心機（賽默飛世爾科技公司）；eclipse E100 型顯微鏡［尼康儀器（上海）有限公司］；Avanti J-E 型離心機［貝克曼庫爾特國際貿易（上海）有限公司］；T100 型熱循環儀、PowerPac?Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 試藥

酵母提取物（批號：4252819-02）、胰蛋白胨（批號：3438287）均購于英國Oxoid 公司；氯化鈉（批號：20210923）、乙醇（批號：20220608）、次氯酸鈉（批號：20220415）、磷酸二氫鉀（批號：20150912）均為分析純，均購于廣東光華科技股份有限公司；瓊脂粉（批號：310U022）、脫脂奶粉（批號：712X052）、溴代十六烷基三甲胺（CTAB）均購于北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨（批號：20130607，北京奧博星生物技術有限責任公司）；牛肉浸膏（批號：20131015）、葡萄糖（批號：20130903）均購于國藥集團化學試劑有限公司；基因組DNA 試劑盒（上海賽百盛生物工程有限公司）；Platinum?Taq高保真DNA 聚合酶（賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸二氫銨、氯化鉀、七水合硫酸鎂、三氯化鐵（Ⅲ）六水合物（純度≥99%）、1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES，純度≥99.5%）、剛果紅、鉻天青S均購于上海晶純生化科技股份有限公司；幾丁質（批號：RT3545U495）、羧甲基纖維素鈉（批號：RF2017G615）均購于上海瑞永生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，批號：C12743758，純度≥98.0%）購于上海麥克林生化科技有限公司。

2 方法

2.1 試驗地點

生防菌篩選小區試驗于2011—2014 年在湖北省漢川市廟頭鎮七屋臺村開展，最佳施用濃度田間試驗于2015—2016 年在同一地方進行；2017—2018 年在湖北黃岡英山縣開展最佳用法用量試驗；2019 年在河北省邯鄲市廣平縣勝營村開展田間推廣應用試驗。

2.2 菌株培養方法

從超低溫冰箱中取出保存菌蠟質芽孢桿菌AR156、枯草芽孢桿菌SM21、沙雷氏菌XY21 等劃線于28 ℃下培養；待長出單菌落，挑取其接入盛有配制好LB 培養基100 mL 的250 mL 錐形瓶中，置于28 ℃搖床里培養18～20 h 后作為種子液；以1%的接種量將種子液接種于1 L 的大錐形瓶培養基里繼續于28 ℃搖床培養22～24 h。LB 培養基配方：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g用超純水定容至1 L，調pH 至7.5。BBS 制作方法：將AR156、SM21、XY21 菌液濃度分別調終濃度為1×108CFU·mL-1、體積比1∶1∶1，混合。

2.3 半夏軟腐病的診斷和病原物的分離純化

2011 年從湖北漢川半夏試驗田采集發病樣品，患病葉片初期出現水燙狀軟腐并死亡，病莖呈現軟腐爛狀；患病塊莖部分或全部腐爛且有臭味。取樣品病健交界處于低倍鏡下觀察是否具有噴菌現象。將觀察到噴菌現象的病健交界處的組織先用緩流自來水沖洗1 min，再于超凈工作臺中用無菌水漂洗3 次后，放到滅菌的1.5 mL 的離心管中，加入無菌水200 μL，發病組織研碎或用剪刀剪碎后浸泡15 min，讓細菌釋放到滅菌水中。滅菌接種環蘸取菌懸液，用三線法分離菌株，做好標記后倒置培養皿，放在26～28 ℃恒溫箱中培養。5 d 內連續觀察，根據菌落特征選擇目標菌株挑單菌落，在營養瓊脂（NA）平板上劃線培養，直到所有單菌落形態一致。可挑取1 個單菌落在NA 斜面（用試管）上劃線培養24～48 h，4 度冰箱培養保存。每月繼代1 次，備用；或取純化好的菌落1 環置于含1 mL 的30%甘油的滅菌的1.5 mL 或2 mL 離心管中，振蕩混合均勻，于-70 ℃保存。NA 培養基配制方法：牛肉浸膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g 用超純水定容至1 L，調pH至7.0±0.1后加瓊脂粉18 g。

2.4 柯赫法則驗證半夏軟腐病病原菌

將2.3 項下從發病部位分離獲得的純化培養物接種到LB 液體培養基中，28 ℃搖床中過夜培養。采用針刺浸泡法接種細菌[6]，選取直徑為1.5 cm左右的健康塊莖，用75%乙醇浸泡1 min后，在50%次氯酸鈉加入0.1% SDS 溶液中置于搖床10 min 進行表面消毒，用無菌水漂洗5 遍。用無菌針在塊莖表面扎10 個孔，在稀釋到1×106CFU·mL-1的菌液中浸泡5 min，置于鋪有濕潤濾紙的無菌培養皿中；對照組用無菌培養基浸泡。將培養皿置于28 ℃培養箱，每24 h 觀察1 次，約48 h可觀察到塊莖變軟，對半切開后組織軟腐潰爛。

半夏塊莖發病后，在超凈臺內切取小塊發病組織，放入盛有無菌水1 mL 的2 mL 離心管中，切碎組織后靜置15 min，取上層液體在NA 平板上劃線培養，放置于28 ℃培養箱中，每天連續觀察菌落形態。

2.5 病原菌16S rRNA 基因聚合酶鏈式反應（PCR）擴增鑒定

采用基因組DNA 試劑盒提取細菌的基因組DNA 后，使用Platinum?Taq高保真DNA 聚合酶進行16S rRNA 片段擴增。16S rRNA 片段擴增引物序列U8-27（F）：5'-AGAGTTTGATC（AC）TGGCTCAG-3'；L1494-1514（R）：5'-CTACGG（AG）TACCTTGTTACGAC-3'。反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+3.75 μL，dNTP 2 μL，引物P1/P2 0.6 μL，模板DNA 1 μL，rTaq酶0.5 μL，加超純水至25 μL。反應參數：94 ℃5 min；94 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃2 min，30個循環；72 ℃10 min后至12 ℃恒溫。

2.6 半夏軟腐病生防菌篩選試驗

2.6.1 生防菌對病原菌平板抑制活性檢測 采用平板對峙法檢測本課題組菌種庫中的生防菌對分離所得病原細菌和已獲得的常見病原菌的拮抗活性，病原指示菌為鑒定為病原物的BX23、鐮刀菌屬（Fusariumsp.），培養平板分別使用LB 固體培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。按參考文獻[7]方法，進行3 次獨立重復試驗，每株參試菌株設置3個重復。

2.6.2 細菌水解酶活性的測定 蛋白酶活性測定：在蛋白酶平板（A：脫脂奶粉8 g，溶于水300 mL中，115 ℃滅菌10 min；B：瓊脂8 g，定容至300 mL，121 ℃滅菌20 min，A 與B 分別滅菌后混合）上接菌，30 ℃培養3 d后觀察有無透明圈，并記錄大小。

幾丁質酶活性測定：將細菌在以膠體狀幾丁質為唯一碳源的培養基上培養（磷酸二氫銨1.0 g、氯化鉀0.2 g、水合硫酸鎂0.2 g，質量分數1%的膠體狀幾丁質100 mL，瓊脂20 g，pH 為7.0），接菌后30 ℃培養3 d，觀察有無透明圈，并記錄大小。

纖維素酶活性測定：把準備好的菌株接到纖維素酶活性測定平板上（蛋白胨10 g、酵母粉10 g、羧甲基纖維素鈉10 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂18 g，pH 為7.0），30 ℃培養3 d 后，用1 g·L-1的剛果紅染1 h 后，倒掉染液，再用1 mol·L-1氯化鈉溶液浸泡1 h，觀察有無透明圈，并記錄大小。

產嗜鐵素活性測定：A ［鉻天青S 60.5 mg溶于去離子水50 mL，三價鐵溶液（1 mmol·L-1FeCl3·6H2O，10 mmol·L-1鹽酸為溶劑）10 mL，CTAB 72.9 mg 溶于去離子水40 mL，上述3 個溶液混合定容至100 mL，pH 調至中性，121 ℃滅菌20 min］、B［PIPES 30.24 g加入水-瓊脂（WA）培養基900 mL，pH 為6.8，121 ℃滅菌20 min］液混合倒平板，接菌后30 ℃培養3 d，觀察，記錄結果。WA培養基：瓊脂4 g，超純水補足100 mL。

2.6.3 潛力生防菌的賦值評估 對拮抗細菌的生防潛力進行賦值評估，平板拮抗BX23、Fusarium.sp活性、產幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶活性各3 分，其中抑菌圈或透明圈半徑0～3 mm 賦1 分，3～6 mm賦2 分，＞6 mm 賦3 分；產嗜鐵素活性1 分，總分為16分。

2.6.4 生防菌篩選小區試驗 生防菌篩選小區試驗面積共2000 m2：每個小區規格為16.0 m×1.5 m，各處理組中間起壟20 cm 做間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2。設置處理組1～30 分別為1×107CFU·mL-1備選生防菌1～30 號處理，處理組31～33分別為相同濃度的A+X、A+S、X+S處理，處理組34～36分別為BBS和乙蒜素（ethylicin，E）、清水處理（CK），播種時種子處理（菌液濃度統一稀釋調節成5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min）。每個處理重復3 次。各個處理組在2013 年8 月進行塊莖浸泡和灌根處理，在9 月下旬再次灌根處理，并于2014 年10 月收獲，期間統計軟腐病發病情況和產量。

由于BBS 前期在其他作物上的防病促生效果，正在將此菌劑開展微生物肥料登記工作，商品名“寧盾”。

2.7 半夏軟腐病有效生防菌劑的最佳濃度、用法和用量篩選小區試驗

2.7.1 “寧盾”最佳施用濃度篩選小區試驗 將2.6項下篩選出的最佳生防菌劑“寧盾”開展施用濃度篩選試驗。每個小區規格為16.0 m×1.5 m，各處理組中間起壟20 cm間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2。設置處理組分別為1×106、1×107、1×108CFU·mL-1的“寧盾”（S6～S8）和CK，每個處理重復3 次。各個處理組在2015 年9 月進行塊莖浸泡和灌根處理，并于2016年10月收獲，期間統計軟腐病發病情況和產量。

2.7.2 “寧盾”最佳用法用量篩選小區試驗 每個小區規格為16.0 m×1.5 m，各處理組中間起壟20 cm做間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2。“寧盾”按以下不同用法進行試驗處理，每個處理重復3次。

用法1：菌液稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min；用法2：菌原液7.5 mL·m-2，稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min，播種后剩余菌液澆到塊莖上之后覆土；用法3：菌原液3 mL·m-2稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min，播種后剩余菌液澆到塊莖上之后覆土；出苗后用菌原液4.5 mL·m-2以同樣濃度對根部噴淋1 次；用法4：菌原液3 mL·m-2稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min，播種后剩余菌液澆到塊莖上之后覆土；出苗后用菌原液3 mL·m-2以同樣濃度灌根1 次；20 d 后地上部噴霧2 次，每次處理間隔15 d，每次噴霧的菌原液用量0.75 mL·m-2。常規處理：播種前使用80% E 乳油2000～2500 倍液浸種，出苗后使用多菌靈50～100 mL 和代森錳鋅25 mL，兌水15 kg噴霧3～4 次。

2.8 田間生防效果驗證

2.8.1 試驗地點、試驗地規劃及試驗方案 河北省邯鄲市試驗點“寧盾”處理半夏面積43 300 m2，常規對照面積3333 m2；實驗組和CK 中間起壟20 cm間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2。處理組按照上述用法4 進行處理；常規對照種植體系以當地常規種植體系為準。

本研究中，除使用“寧盾”來防治病害之外，在處理組中還使用辛硫磷、苦參堿等與“寧盾”具有兼容性的化學殺蟲劑防治地下害蟲、蚜蟲等蟲害，出苗后使用稻草覆蓋防治草害，構成了有益微生物驅動的全程綠色種植體系（簡稱BeMMG 體系）。當地常規對照體系中施用多菌靈、波爾多液或代森鋅防治軟腐病，施用吡蟲啉、噻蟲胺防治蟲害，施用精喹禾靈防治草害。

2.8.2 植物生長指標及產量測定 按公式（1）計算出苗率。

半夏生長期采用五點取樣法，調查半夏的株高、葉片長、葉綠素和珠芽分化率。按公式（2）計算倒苗時倒苗率。

半夏收獲時挖出處理組及CK 的半夏球莖，按公式（3）使用游標卡尺測量半夏塊莖的直徑。

除盡泥土和雜物后分別稱質量，進行統計分析，折算每公頃產量并比較球莖大小及外觀，記錄。

2.8.3 軟腐病防效統計 軟腐病分級按以下標準。0 級：健株無病；1 級：腐爛面積10%以下；2 級：腐爛面積10%～50%；3 級：腐爛面積50%以上；4級：全株枯死。按公式（4）～（7）分別計算病害嚴重度、防治效率、發病率和增產率。

3 結果

3.1 半夏軟腐病的診斷其病原物鑒定結果

健康半夏地上部通常有葉片2～5 枚，有時1 枚，幼苗葉片卵狀心形至戟形，為全緣單葉；老株三出復葉，呈橢圓形或披針形，兩頭尖銳（圖1A）；塊莖呈球形，具須根。感病半夏地上部癥狀表現為葉片初期出現水燙狀，后期表現軟腐并最終死亡，病莖呈腐爛狀倒伏；患病塊莖呈軟腐爛狀，其內組織呈石灰粉粒狀，濕性腐爛且有臭味（圖1B～C）。通過柯赫氏法則驗證了引起半夏球莖病害的病原菌，首先對發病半夏球莖進行分離，將主要分離物BX23進行純化培養，采用針刺浸泡和針刺法對健康半夏球莖進行回接。如圖1C 所示，BX23 可造成半夏塊莖出現同樣的軟腐癥狀。再對BX23 處理發病球莖進行分離，并將分離物進行純培養。提取細菌的基因組DNA 后，進行16S rRNA 基因片段擴增，擴增結果見圖2。從回接發病的組織中分離得到菌株與BX23 測序比對結果相同。菌株的16S rRNA 基因測序表明，序列全長1509 bp，與美國國立生物技術信息中心（NCBI）上相似序列經基于局部比對算法的搜索工具（Blast）比對，其與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorumNkyhuaya菌株（HM622348.1）、Ecc131-1菌株（FJ593031.1）、301480菌株（FJ593025.1）報告的序列相同點均為99%，半夏軟腐病原菌初步鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum。

圖1 半夏生長形態及軟腐病發病癥狀

圖2 半夏軟腐病病原菌16S rRNA PCR片段擴增結果

3.2 生防菌株室內篩選及賦值

為了比較15 種備選的生防菌對病原菌的拮抗效果，進而從中篩選出效果最佳的生防菌進行田間試驗，筆者進行平板抑制活性檢測和水解酶活性檢測，并根據抑菌圈和水解透明圈直徑對不同生防菌進行賦值評價。如表1 所示，生防菌株AR156、SM21、XY21 具有較高的賦值。對這3 種菌株設計不同的組合，分別進行賦值評估，結果證明AR156+SM21+XY21，即BBS組合菌劑具有最高賦值得分。

表1 參試生防菌株對半夏軟腐病病原物BX23的拮抗活性

3.3 生防菌株田間小區試驗篩選結果

本研究于2014 年在湖北漢川通過小區試驗來篩選對半夏軟腐病具有防治效果的生防菌，采取五點取樣法采集半夏地下塊莖，每重復各取面積為0.2 m2的5 點；各點半夏球莖挖出后集中在一起，清理泥土雜物后測定數據；由于田中幾乎不見發病球莖，推斷發病球莖前期已完全腐爛，在此以直徑≥1 cm 球莖的數量作為半夏細菌性軟腐病防治效果的參考數據。如表2所示，備選生防菌中，JC03菌株和AG11菌株對軟腐病防效較好，防治效率分別為58.51%和55.71%，但在相同濃度下BBS 菌劑使用效果最佳，防治效率和增產率分別為84.30%和35.70%。BBS中3 種有效菌株兩兩組合的效果次于三菌合劑的效果。因此，選擇BBS（其間獲得微生物肥登記，商品名為“寧盾”）用于后期試驗中。

表2 田間小區試驗中各處理對半夏對防病促生效果（n=5）

3.4 “寧盾”最佳濃度和用法用量的確定

為探究在節約成本的前提下哪種濃度的使用效果最佳，本研究于2016 年在湖北漢川設置了最佳施用濃度篩選試驗。試驗結果顯示，“寧盾”菌劑在濃度為1×107、1×108CFU·mL-1的條件下使用效果均較好，對軟腐病的防治效率分別為76%、77.67%，增產率分別為25.58%、25.00%（表3）。從節約成本的角度考慮，建議選擇1×107CFU·mL-1為施用濃度，即原液稀釋約200倍。

表3 2016年各濃度BBS菌劑處理對半夏防病效果和增產效果（n=5）

為了確定“寧盾”最佳使用方案，于2018 年在湖北英山開展最佳用法用量篩選小區試驗，設計了4種處理方法。試驗結果表明在相同的用量下，以方法4為最佳用法，即“寧盾”菌劑以1×107CFU·mL-1的濃度對半夏浸種后澆灌，并在出苗后的不同時期進行灌根和葉面噴霧處理，防治半夏軟腐病效果達到83.2%、增產29.89%（表4）。說明半夏軟腐病菌在種植全程均可侵染，將微生物菌劑分成多次施用可取得更好的防病、促生效果。

表4 不同處理對半夏的防病促生效果（n=5）

3.5 大田試驗中“寧盾”對半夏軟腐病的防治效果

2013 年，BBS 登記為微生物肥［登記證號：微生物肥〔2013〕準字（1096）號］，商品名為“寧盾”。在2019 年于河北邯鄲開展半夏全程綠色種植試驗時，“寧盾”能顯著降低半夏軟腐病的發生。“寧盾”處理組的軟腐病發病率和病害嚴重度分別為6.7%、3.0%，而CK 為46.7%和26.7%，“寧盾”處理對半夏軟腐病的防治效率為88.7%，該結果與上述篩選試驗結果一致。總體來看，處理組的防治效果明顯高于CK，證明生防菌劑“寧盾”能有效防治半夏軟腐病。

3.6 田間試驗中“寧盾”對半夏的促生效果

田間試驗結果證明，“寧盾”對半夏具有良好的促進生長效果。如圖3 所示，與CK 相比，“寧盾”處理后98 d 植株出苗率和存活率更高，地上部生長也更茂密，葉片更大更綠，株高較高。移栽后98 d通過五點取樣法，測量各處理中半夏各項生長指標。如表5 所示，與CK 相比，“寧盾”處理組的半夏在株高、葉片長和珠芽分化率上均有不同程度提高。其中，出苗率、珠芽分化率和分蘗數分別增加52.8%、65.7%和19.2%，表明施用“寧盾”能促進半夏地上部生長，特別是對珠芽的分化的促進作用顯著。珠芽作為半夏主要繁殖器官，因此推測“寧盾”處理可以加大半夏繁殖基數，在生產實踐中提高半夏產量。

表5 “寧盾”處理98 d對半夏的促生效果（n=100）

圖3 “寧盾”處理98 d后對半夏的田間促生效果

從邯鄲試驗點的產量統計結果來看，“寧盾”處理240 d 后半夏塊莖平均直徑為1.61 cm，產量達7650 kg·hm-2；而CK 平均直徑為1.49 cm，產量為6300 kg·hm-2。在相同投量下，“寧盾”處理使產量提高21.43%。綜合上述試驗結果，“寧盾”確實能夠促進光合作用和光合產物積累、增加繁殖體數量，進而提高半夏的產量。

4 討論

半夏軟腐病主要為害葉、莖和塊莖。癥狀表現為患病葉片，初期出現水燙狀軟腐并死亡，病莖呈軟腐爛狀；患病塊莖迅速部分或全部腐爛且有臭味。高溫高濕和通風不良是發病的主要條件，因此做好排水工作十分重要。在常規種植體系中，防治軟腐病的藥劑有：50%氯溴異氰尿酸WP（消菌靈）、0.3%四霉素AS、3%中生霉素WP（橫掃殲菌）、20%噻森銅SC、青枯立克、25%大蒜素WP 等，但化學藥劑之間不宜隨意混用，使用不當容易造成藥害。另外，廣譜殺菌劑不僅對病原菌起作用，還可能影響其他有益微生物，破壞土壤微生物群落結構。因此，急需有效、安全、可靠的生物防治方式來控制這一病害。

據中國農藥信息網數據顯示，我國國內登記用于防治軟腐病的產品共18 種，其中生物農藥有4種，均為防治大白菜軟腐病的枯草芽孢桿菌B.subtilis。根據美國國家農藥通訊網（National Pesticide Information Center）產品在線搜索網站（http://npic.orst.edu/NPRO/#）記錄，目前投入使用的防治細菌性軟腐病的產品共200 種，其中生防菌產品有21種，為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens和枯草芽孢桿菌B.subtilis產品，但防治草藥病害的生防產品寥寥無幾。由此可見，目前國內外已產業化防治軟腐病的生防產品組成單一，具有田間防效不穩定的風險，尤其是中藥材軟腐病及其生物防治產品仍有巨大發展空間。

細菌性軟腐病可由多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌引起，其中Dickeyaspp.和Pectobacteriumspp.是研究最為廣泛的軟腐病病原菌[8]。D.zeae在香蕉上引起香蕉細菌性軟腐病，造成葉片萎蔫、假莖塌陷和異味[9]。Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc）可以造成大白菜、馬鈴薯及天南星科中藥材大角蓮Typhonium giganteum軟腐病[10-12]。有報道，研究人員鑒定了浙江蕭山和湖北京山縣發病半夏中病原物為Pcc[13-14]，本研究證明了引起湖北漢川地區半夏軟腐病的病原菌為Pectobacterium carotovorum。在生物防治方面，研究表明解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens菌株對馬鈴薯軟腐病菌Pectobacterium carotovorum菌株Ⅱ16 具有拮抗作用[15]，B.amyloliquefaciensKC-1能有效防治Pcc引起的大白菜軟腐病[10]。Maciag等[16]開發了由5 種生防菌株（S.plymuthicaA294、Enterobacter amnigenusA167、Rahnella aquatilisH145、S.rubidaeaH440和S.rubidaeaH469）制成的粉劑配方可顯著降低馬鈴薯塊莖的軟腐病嚴重度和發病率。這些結果表明，生防菌株組合可作為一種軟腐病防治策略。

通過多角度賦值和小區篩選試驗，本研究比較了15 種備選生防菌的生防效果，篩選獲得由蠟質芽孢桿菌B.cereusAR156、枯草芽孢桿菌B.subtilisSM21、沙雷氏菌S.sp.XY21組成的“寧盾”。本課題組前期在湖北省孝感市開展的中藥材茅蒼術生防試驗中篩選出“寧盾”對茅蒼術軟腐病防效最佳灌根濃度為75 L·hm-2[17]，并發現在該濃度使用“寧盾”對扁豆進行灌根有增產作用和作物品質改良作用[18]。沈建華等[19]研究結果表明，微生物菌劑“菌刀”通過灌根處理加葉面噴施處理的施用方法在“陽光玫瑰”葡萄上效果最好；另有研究表明，土壤消毒與塊莖處理結合的方法防治半夏塊莖腐爛病效果顯著[20]。根據半夏軟腐病多發生在高溫多濕季節和越夏種莖儲藏期間，首先半夏塊莖發生腐爛，后蔓延到地上部分，最后黃倒苗而死亡的特點[21]。本研究確定了“寧盾”最佳使用方法為“浸種+灌根+噴淋+噴霧”及其最佳使用濃度為1×107CFU·mL-1。半夏軟腐病菌可在土壤和病殘體中越冬，環境條件適宜時可隨雨水、灌溉水、昆蟲、肥料、土壤等多種途徑傳播蔓延，因此半夏軟腐病可在生長周期內全程侵染，7月下旬至8月上旬高溫多雨，是病害高發生時期[21]；半夏種植土壤沙性較強，便于采收挖掘塊莖，但不利于微生物的快速定殖，這也許可以解釋為什么微生物菌劑分成多次施用效果更佳。

與CK 相比，“寧盾”處理組的半夏在株高、葉片長、分蘗數和珠芽分化率上均有提高。珠芽多著生于葉腋，可用來繁殖或入藥，多認為是腋芽形成的地上變態莖或腋芽變態，也稱為“小塊莖”“珠芽”“地上塊莖”[22]。因此，推測“寧盾”處理可以促進地上部塊莖的分化，從而提高半夏繁殖用種量，在生產實踐中提高半夏的種植產量。實驗過程中還發現，“寧盾”處理組的半夏倒苗期相對推遲的現象，地下部塊莖的生長期延長亦可增加半夏產量。而收獲期測產結果表明，“寧盾”處理組收獲的半夏塊莖直徑和產量均顯著高于CK，證實了“寧盾”能夠增加繁殖體數量，促進光合作用和光合產物積累，從而達到提高產量的效果。本研究鑒定了半夏軟腐病菌為Pectobacterium carotovorum，發現“寧盾”對半夏軟腐病具有良好的防治效果并能提高半夏品相與產量，為軟腐病的生物防治和該生防菌劑的產業化可行性提供依據。