異地種植對PA型紫蘇葉酚酸黃酮類成分及揮發油的影響

落艷嬌，張琛武，郭佳琪，李衛萍，姚宇，申國安，徐超群，索風梅，郭寶林*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.山西藥科職業學院，山西 太原 030031

紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.在我國分布范圍廣泛，生長環境差別很大。紫蘇葉作為常用中藥，具有解表散寒、行氣和胃等功效，用于風寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚蟹中毒，常作為食用香料、食物色素和蔬菜[1]。其主要含有揮發油、酚酸和黃酮類成分，其中揮發油可作為原料直接入藥起到清熱解表作用，或者用作香料和食物防腐；酚酸類成分具有抗炎、抗菌、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁、保肝、降血糖和調血脂等作用[2]；黃酮類成分具有顯著的抗炎、抗氧化、抗過敏和調節糖脂代謝的作用[3]。紫蘇葉中揮發油也稱為紫蘇葉油，因主要成分類型的差異分為紫蘇酮（PK）型、紫蘇醛（PA）型、紫蘇烯（PL）型、香薷酮（EK）型等，也將含有該類揮發油的紫蘇稱為相應的化學型。其中，只有PA 型紫蘇是符合《中華人民共和國藥典》2020年版紫蘇葉項下要求的類型[4-5]。國內PA型紫蘇的資源較為缺乏[5]，是值得深入研究和開發的資源類型。本課題組前期研究了20 份紫蘇種質在2 個區域種植對PK型、PA型、PL型、EK型等多種化學型構成成分的影響，發現化學型基本沒有變化[6]。本研究遴選出5 份PA 型紫蘇種質，研究其在3 個不同區域種植后揮發油含量和組成，以及8 個主要酚酸和黃酮類成分的變化，以探究不同環境對其可能產生的影響及未來品種推廣可能面臨的質量變化。

1 材料

1.1 樣品

所用5 份PA 型紫蘇材料（編號：AG-12、BJ-2、JS-1、ZhJ-z1 和RB-1）經中國醫學科學院郭寶林研究員鑒定為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的種植類型變種回回蘇P.frutescensvar.crispa（Thunb.）Hand.-Mazz.，于2018 年9 月，各地各種質植株主莖頂序現序時，在上午8—11 時采收。每個種質取3份樣品，每份來自于5個個體全株葉片的混合，鮮品不少于300 g，除去雜質后陰干備用。

1.2 儀器

ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；New Classic MS 型十萬分之一天平（上海Mettler-Toledo 公司）；FA2014N 型分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GZX-9070 MBE 型數顯鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；Trace 1310-ISQ 型氣相質譜聯用儀（美國Thermo Finnigan公司）；EYELA N-1100型旋轉蒸發儀、CA-1111型循環式真空泵（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 試藥

對照品野黃芩素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（SDG，批號：102782）、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（LDG，批號：102779）、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（ADG，批號：102780）均購于江蘇永健醫藥科技有限公司，咖啡酸（CA，批號：160815）、迷迭香酸（RA，批號：160724）均購于南京森貝伽生物科技有限公司，野黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷（SG，批號：1445）、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（LG，批號：3187）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（AG，批號：3075）均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司，所有對照品經面積歸一化法測定純度均大于98%；乙腈、正己烷（色譜純，美國Fisher 公司）；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 田間試驗

將5 份PA 型紫蘇材料于2018 年4 月分別在北京市海淀區中國醫學科學院藥用植物研究所南園種植試驗田、甘肅省慶陽市正寧縣現代農業示范園種植試驗田、安徽省阜陽市太和縣雙浮鎮水蛭繁殖基地種植試驗田栽培。5月下旬至6月上旬（種苗株高至10 cm）選擇高度一致、生長健壯的種苗，于陰天落日時分進行移栽，種植密度為5500 株/畝（1 畝≈666.67 m2，株行距：30～40 cm），每種材料種植5行，每行12 株。3 個地點土壤均中上等肥力，常規水肥管理。

北京試驗田位于北京市海淀區馬連洼北路藥用植物研究所院內。試驗田地勢平坦，土壤類型為砂壤土，基礎肥力中等偏上，位于N39°47'，E116°25'，海拔為50 m，屬于溫帶半濕潤大陸性季風氣候，年平均氣溫8～12 ℃，年降水量約600 mm，年日照時數2778 h，無霜期190 d左右。

甘肅試驗田位于甘肅省慶陽市正寧縣現代農業示范園。試驗田地勢平坦，土壤類型為黃綿土，基礎肥力中等，位于N35°41'，E108°37'，海拔為1360 m，屬于溫帶大陸性半濕潤氣候，年平均溫度8～9 ℃，年降水量460～600 mm，年日照時數2447 h，無霜期180 d左右。

安徽試驗田位于安徽省阜陽市太和縣雙浮鎮水蛭繁殖基地。試驗田地勢平坦，土壤類型為黃潮土，基礎肥力中等，位于N33°15'，E115°36'，海拔為32.5 m，屬于暖溫帶半濕潤季風氣候，年平均溫度14～16 ℃，年降水量約850 mm，年日照時數2444 h，無霜期220 d左右。

2.2 酚酸和黃酮類成分含量測定

將紫蘇葉樣品粉碎，過四號篩，精密稱取烘干至恒重的樣品粉末0.5 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入40%甲醇60 mL，密塞，分2 次進行超聲，共60 min，靜置，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，按參考文獻[7]方法測定。

2.3 揮發油測定

將紫蘇葉樣品粉碎，過四號篩，精密稱取50 g，用水蒸氣蒸餾法提取，經無水硫酸鈉干燥后用正己烷稀釋1000 倍，定容至5 mL，按參考文獻[5]方法測定。

3 結果

3.1 PA型紫蘇酚酸及黃酮類成分含量變化

3.1.1 含量測定結果 5 份PA 型紫蘇種質在3 個栽培地種植后8個成分的含量測定結果見表1。

3.1.2 多元方差分析主體間效應檢驗 將表1 數據導入SPSS 19.0進行多因素方差分析，結果見表2。

表1 5份PA型紫蘇種質在不同栽培地種植后8個成分及總酚酸、總黃酮的質量分數 mg·g-1

根據表2主體間效應檢驗顯示，不同種質中LDG質量分數差異有統計學意義（P＜0.05），不同種植地區紫蘇中CA、LG、LDG、ADG 和總黃酮質量分數差異有統計學意義（P＜0.05）。因此，本研究主要分析上述對含量差異有統計學意義的因素，即分析不同地區種植對PA型紫蘇葉酚酸和黃酮的影響。

表2 紫蘇種質和種植地區對紫蘇各成分質量分數的主體間效應檢驗

3.1.3 不同地區紫蘇中含量差異有統計學意義的成分的分布規律 采用SPSS 19.0 進行進一步的數學分析，并將含量差異有統計學意義的樣本進行分類，不同成分的地區差異見表3。

表3 紫蘇中不同成分的地區差異檢驗（n=5）

根據數據分析可見，所有含量差異有統計學意義的成分在地區上都分成2 個差異性子集，其中，CA 在北京地區含量最高，明顯高于其他地區；LG在甘肅和北京地區含量最高（甘肅略高于北京），明顯高于安徽地區；LDG 在甘肅地區含量最高，高于北京地區，但是北京地區從差異性上分析，既可以劃分為甘肅地區的高含量子集，也可以劃分為安徽地區的低含量子集；ADG 和總黃酮都是甘肅地區最高，明顯高于其他地區。由此分析認為，甘肅地區對于PA 型種質的LG、LDG、ADG 和總黃酮含量有增加的影響，北京地區對CA、LG 和LDG 含量有增加的影響。

由圖1 可知，甘肅地區種植的紫蘇LDG、ADG及總黃酮質量分數較高，其次是北京地區，安徽地區各成分質量分數較低。

圖1 5份紫蘇種質在3個地區種植CA、LG、LDG、ADG及總黃酮的質量分數

不同種質的LDG 和LG、ADG 和總黃酮在不同種植地存在地區差異，且不同種質對環境的響應存在共性特點，即甘肅地區含量最高。而與黃酮類成分相比，酚酸類成分的地區差異不明顯，僅北京地區種植的種質中咖啡酸含量顯著高于其他地區。

3.2 PA型紫蘇揮發油變化

采用氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）對所有紫蘇葉揮發油樣品進行分析，通過NIST 2.0 數據庫進行檢索，通過核對文獻資料，共鑒定了32 個化合物以面積歸一化法得到各成分的相對質量分數。由于PA 型紫蘇葉揮發油的主要成分為紫蘇醛，有少量檸檬烯、石竹烯和法尼烯。PA 型紫蘇的主要成分的分析結果見表4。

根據表4 可知5 份PA 型紫蘇種質異地種植葉揮發油質量分數差異明顯，甘肅地區的紫蘇種質（ZhJ-z1 除外）揮發油質量分數均顯著高于其他兩地，平均為0.82%；北京地區其次，揮發油質量分數平均為0.58%。安徽地區的揮發油質量分數平均最低，僅為0.46%。尤其以AG-12 和BJ-2 在兩地間的差異最明顯，AG-12 在甘肅地區（0.98%）是安徽（0.34%）的2.88 倍，BJ-2 在甘肅（0.87%）是安徽（0.32%）的2.71倍。

根據表4 數據繪制5 種PA 型紫蘇種質異地種植葉揮發油主要成分差異（圖2），可以看出，各PA型種質揮發油成分異地種植后相對質量分數有所不同，整體來看，甘肅地區對于紫蘇醛的相對質量分數普遍較高，AG-12 等北方種質的紫蘇葉中紫蘇醛相對質量分數在甘肅地區（75.74%）最高，但是ZhJ-z1的紫蘇醛以安徽（63.52%）最高。安徽地區的石竹烯和法尼烯相對質量分數普遍高于其他兩地，甚至AG-12 樣本的石竹烯和法尼烯相對質量分數之和已高于紫蘇醛。北京地區種質樣本普遍檢測到檸檬烯，其他地區相對質量分數較少。安徽地區紫蘇醇相對質量分數普遍較高，與種質并無完全對應關系，AG-12的紫蘇醇相對質量分數最高達到3.09%。

表4 5種PA型紫蘇種質異地種植葉揮發油質量分數及各成分相對質量分數 %

圖2 5種PA型紫蘇種質異地種植葉揮發油主要成分差異

整體來講，各PA 型種質均為甘肅的揮發油質量分數最高（ZhJ-z1除外），紫蘇醛相對質量分數最高（除ZhJ-z1 外），其次是北京種植后揮發油質量分數和紫蘇醛相對質量分數基本居中（僅ZhJ-z1 較低），在安徽種植后紫蘇醛相對質量分數普遍較低（僅ZhJ-z1較高）。初步推測南部地區種質在北方試驗田種植，含量受到較大影響，有待進一步分析討論。

4 討論

本研究認為，酚酸類成分對環境變化的響應差異無統計學意義，只有CA在北京地區含量普遍較高；50%以上黃酮類成分差異有統計學意義（P＜0.05），LG、LDG、ADG 和總黃酮都在甘肅種植后利于獲得較高含量，而其他黃酮類成分差異并不明顯。

通過揮發油研究發現甘肅地區種植的紫蘇所產紫蘇葉揮發油品質最高，葉揮發油含量及葉揮發油中紫蘇醛相對含量均突出高于北京及安徽地區的結果；北京地區種植的紫蘇所產紫蘇葉品質其次，葉揮發油含量及葉揮發油中紫蘇醛相對含量略低于甘肅，而安徽地區種植的紫蘇所產紫蘇葉品質最低，葉揮發油含量最低，與甘肅地區相較減少近1/2，紫蘇醛相對含量也最低，法尼烯含量較高。PA 型紫蘇作為藥用，以紫蘇醛為主要成分，可以把紫蘇醛相對含量高的甘肅地區作為種植葉用紫蘇的優勢地區。除紫蘇醛外，北京地區種植的紫蘇中檸檬烯含量較其他地區高，安徽地區種植的紫蘇中紫蘇醇含量較其他地區高，同樣值得關注。不同環境對紫蘇萜類成分合成可能有所影響。

環境因素影響植物代謝過程中生化途徑和生理過程從而影響揮發油的生物合成，大多數情況紫蘇種質不會因為環境的變化導致化學型的改變[6]。本研究的5 份PA 型種質的化學型都沒有變化，但不同種植地的成分組成有所變化，AG-12、BJ-2、JS-1、RB-1 的紫蘇醛均在甘肅有最高相對含量，而ZhJ-z1的紫蘇醛在安徽最高，但低于其他4 個種質的最高紫蘇醛相對含量，JS-1 同樣是南方種質并不存在ZhJ-z1 在揮發油含量變化上的規律，并且在酚酸和黃酮方面，南方種質的ZhJ-z1 在甘肅地區依然會含量增加，所以目前的數據結果并不能證實種質的南北方差異會影響含量。值得關注的是，BJ-2 在北京地區有較高的檸檬烯，這可能是種植環境變化而引起單萜合成中關鍵酶的活性或腺毛散發的單萜種類不同導致[6]。針對化學型相同的PA 型不同種質，仍舊存在遺傳的差異，對于環境變化帶來的次生成分變化還需要更多的研究數據來支撐。

綜合5 份PA 型紫蘇種質的情況，就本文所涉及的3 塊試驗田而言，甘肅地區的黃酮含量、紫蘇醛相對含量、揮發油含量都是最高的，可以作為適宜藥用紫蘇PA 型種質的種植地。北京地區也較為適宜PA型紫蘇種質的生產。