UPLC-MS/MS同時測定寧夏枸杞中香豆素類和苯丙酸類9個成分的含量△

康志欣，袁雪琴，張春陽，楊孟可，王衛華，劉賽*，徐常青*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.清華大學 藥學技術中心，北京 100084

寧夏枸杞Lycium barbarumL.為茄科枸杞屬（LyciumL.）落葉灌木，其干燥成熟果實（枸杞子）、干燥根皮（地骨皮）、干燥嫩葉（天精草）、干燥花蕾（長生草）均可入藥[1-2]，是我國傳統名貴中藥材，隨著市場需求不斷擴大，其種植規模[3]及出口總量正逐年遞增[4]。由于寧夏枸杞適應性強，具有耐鹽堿、耐干旱和耐貧瘠等優良特性，被作為寧夏、青海、甘肅等西北地區產業扶貧、鄉村振興、改善生態環境的先鋒樹種[5-6]。

香豆素類成分是植物界普遍存在的一類次生代謝物質[7]，通過苯丙烷途徑合成[8]，在植物體內易受到環境脅迫（生物或非生物脅迫）誘導合成[9]。近年研究發現，東莨菪內酯和秦皮素等香豆素類成分及其糖基化合物東莨菪苷、秦皮苷、秦皮甲素等在植物適應環境中具有非常重要的生態功能，主要體現在3 個方面：1）在植物養分吸收利用方面，香豆素類成分可通過螯合三價鐵離子等方式幫助植物吸收鐵營養，在緩解堿性土壤導致的鐵營養缺乏中起著至關重要的作用[10]；2）在植物-微生物互作方面，香豆素類成分被證實可以介導多種微生物互作，是植物與微生物及環境進行信息交流的關鍵信號物質，其中東莨菪內酯被證明具有選擇性抗菌作用，可以維系健康的根際微生物環境[11]；3）香豆素類成分是重要的酚類植保素及信號分子[12-14]，在植物遭受病、蟲害時可大量合成和積累，在植物抗病[15-16]、抗蟲[17-19]等響應生物脅迫中也具有重要作用。同時，香豆素類成分具有抗凝血[20]、抗癌[21]、抗病毒[22]和抗炎[23]等多種藥理作用，是一類具有重要藥理活性的化合物，近年越來越受到關注[24]。

前期研究發現，枸杞各部位如根[25-26]、葉[25]、果實[27-28]、種子[29]中均可檢出香豆素類成分，尤其是東莨菪內酯和東莨菪苷，是枸杞子、地骨皮、天精草中重要的有效成分[30-32]，東莨菪內酯被認為是枸杞子中抑制前列腺癌細胞PC3 增殖效果最好的活性成分[33]，東莨菪苷則被認為是枸杞葉中抑制宮頸癌細胞HeLa 增殖的主要活性成分[32]。此外，寧夏枸杞生長在西北鹽堿土壤環境中[34-35]，且生長過程病蟲種類多、為害嚴重[36-37]，推測香豆素類成分在其適應各種生物及非生物脅迫，尤其對根系營養吸收、適應鹽堿脅迫、調節根際微生物群落及協助植株抗病蟲等方面具有重要作用。本研究采用超高效液相色譜-質譜法（UPLC-MS/MS）同時測定了寧夏枸杞中5個香豆素類化合物（東莨菪內酯、東莨菪苷、秦皮素、秦皮苷和秦皮甲素）、3 個與香豆素合成有關的苯丙酸類化合物（咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸）及1 個東莨菪苷的同分異構體（綠原酸）共9 個成分，并對該方法進行方法學考察。同時還比較了同一種植基地有機種植（不使用任何化學合成的肥料、農藥、生長調節劑等物質）和常規種植寧夏枸杞不同部位中各成分含量的差異，以期為寧夏枸杞中香豆素類成分研究提供便捷的檢測方法，同時為高品質枸杞定向培育及寧夏枸杞資源開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Elion LC?型超高效液相色譜儀串聯Triple Quad 5500+型三重四極桿質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；XP 26型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；5810 R型冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）；MVM25型多管振蕩器（QLab 公司）；WD-9415C 型超聲波清洗器（北京市六一儀器廠）；MILLI-Q 型超純水機（德國Merck Millipore 公司）；JSP-100 型高速多功能粉碎機（永康市金穗機械制造廠）；WGL-230B 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

樣品于2021年7月采自寧夏中衛市中寧縣鳴沙鎮璽贊生態枸杞莊園（常規種植：N37.46°，E105.93°；有機種植：N37.47°，E105.95°），經中國醫學科學院藥用植物研究所徐常青研究員鑒定為寧夏枸杞Lycium barbarumL.（寧杞7號）。

在有機和常規2 種種植方式的試驗地內各任選30 株寧夏枸杞（其中每10 株為1 個生物學重復，共3 個生物學重復），分別采收青果、中果、紅果、葉片和根，每份樣品取鮮樣20～50 g，其中青、中、紅果為按照果實顏色及大小劃分的不同成熟度果實，葉片為葉長≥5.00 cm 的功能葉，根為挖開植株后截取的部分植株根系（以主根為主），清洗表面泥土等雜質后用手術刀刮取根皮為待測樣品，見圖1。

圖1 寧夏枸杞紅果、中果、青果、葉片和根樣品

對照品東莨菪內酯（批號：Z13O11X126864）、秦皮素（批號：Y07D9Q77007）、秦皮苷（批號：Y13N11Q130724）、秦皮甲素（批號：KA0422CA14）均購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；對照品東莨菪苷（批號：CHB201131）、咖啡酸（批號：CHB201217）、阿魏酸（批號：CHB201105）、對香豆酸（批號：CHB210106）、綠原酸（批號：CHB201114）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司，純度≥98%；乙腈（批號：210280）、甲醇（批號：211218）、甲酸（批號：207052）、異丙醇（批號：205316）、乙酸銨（批號：191008）均為色譜純，購于Fisher Chemical 公司；二甲基亞砜（分析純，批號：111115，西隴化工股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 UPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 色譜條件 Waters XSelect HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.5μm），以乙腈（含0.5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲酸，A）-水（含0.5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲酸，B）為流動相，梯度洗脫（0～2.0 min，0～20%A；2.0～5.0 min，20%A；5.0～8.0 min，20%～60%A；8.0～10.0 min，60%～100%A；10.0～12.0 min，100%A；12.0～12.1 min，100%～0A；12.1～16.0 min，0A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL。

2.1.2 質譜條件 正、負離子模式切換電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓為5.5 kV/-4.5 kV，多反應監測模式（MRM），氣簾氣壓力為206.84 kPa，噴霧氣（GS1）壓力為379.21 kPa，輔助加熱氣（GS2）壓力為413.69 kPa，離子源溫度為550 ℃。9 個成分質譜條件見表1。

表1 寧夏枸杞中香豆素類和苯丙酸類9個成分的質譜檢測參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品東莨菪內酯、東莨菪苷、秦皮素、秦皮苷、秦皮甲素、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸和綠原酸，溶于甲醇（微量二甲基亞砜）中制備成質量濃度為2 mg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取9 個化合物的對照品儲備液，用20%甲醇配制成質量濃度為1.00 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 樣品烘干，打粉過篩（60 目），再次將粉末烘至恒重。精密稱取樣品50.00 mg，加入80%甲醇配制成50.00 mg·mL-1的母液。渦旋3 min（2500 r·min-1），超聲提取20 min（100 Hz，200 W，20 ℃），渦旋3 min（2500 r·min-1），離心10 min（8 ℃、13 000 r·min-1，離心半徑為9.57 cm），取上清液加入適量20%甲醇稀釋后（稀釋倍數參考線性范圍，保證待測樣品測定值符合線性范圍），再次離心10 min（8 ℃、13 000 r·min-1，離心半徑為9.57 cm），上清液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取混合對照品溶液及供試品溶液，按2.1 項下條件進樣，即可得各待測成分的總離子流色譜（TIC）圖，進行離子對選擇后得到各成分的提取離子色譜（XIC）圖，見圖2。

圖2 混合對照品溶液和寧夏枸杞供試品溶液的XIC圖

2.3.2 線性關系和檢測限、定量限考察 精密吸取2.2.1 項下混合對照品溶液，用20%甲醇梯度稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00、1 000.00 ng·mL-1的16 個不同質量濃度混合對照品溶液。按照2.1 項下條件進樣分析，以峰面積為縱坐標（Y），對應的質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，以信噪比（S/N）=10 的進樣質量濃度為定量限（LOQ），以S/N=3的進樣質量濃度為檢測限（LOD），結果見表2。

表2 寧夏枸杞中香豆素類和苯丙酸類9個成分的回歸方程、線性范圍、LOD和LOQ

2.3.3 精密度試驗 精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液，用20%甲醇分別配制25.00、250.00 ng·mL-12個質量濃度的混合對照品溶液，分別連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，東莨菪內酯、東莨菪苷、秦皮素、秦皮苷、秦皮甲素、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸和綠原酸在25.00 ng·mL-1時峰面積的RSD 分別為1.80%、4.52%、2.44%、1.55%、0.48%、1.52%、2.68%、1.30%、6.10%；在250.00 ng·mL-1時峰面積的RSD 分別為0.30%、2.49%、0.75%、0.96%、1.15%、2.23%、0.84%、1.09%、2.11%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于進樣室（10 ℃）和室溫（22 ℃）保存，將進樣室內的供試品溶液依次于0、2、4、8、16、24 h 進樣測定，室溫下的供試品溶液放置24 h 后進樣測定。結果顯示，東莨菪內酯、東莨菪苷、秦皮素、秦皮苷、秦皮甲素、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸和綠原酸峰面積的RSD分別為1.26%、1.89%、5.22%、1.77%、1.71%、2.12%、3.07%、1.27%、1.75%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 精密稱取6 份同一批樣品，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下條件進樣分析。結果顯示，東莨菪內酯、東莨菪苷、秦皮素、秦皮苷、秦皮甲素、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、綠原酸的平均質量分數分別為81.40、368.67、0.22、0.35、0.04、43.58、53.07、12.87、180.33 μg·g-1，RSD 分別為0.90%、2.23%、4.44%、7.11%、2.24%、2.63%、1.34%、1.36%、1.52%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 將2.2.1項下2.00 mg·mL-1的對照品儲備液分別用80%甲醇稀釋成東莨菪內酯、東莨菪苷、秦皮素、秦皮苷、秦皮甲素、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸和綠原酸質量濃度依次為20.00、20.00、0.20、0.20、0.02、20.00、20.00、2.00、20.00 μg·mL-1的對照品溶液。精密稱取已知含量的樣品粉末12份，其中6份按照目標成分約100%的含量精密加入相應質量濃度的對照品溶液，按2.2.2項下方法同時制備樣品供試品溶液及加標樣供試品溶液，在2.1 項下條件測定分析，計算回收率及RSD，見表3。

表3 寧夏枸杞中香豆素類和苯丙酸類9個成分的加樣回收率結果

2.4 統計學方法

采用SPSS 21.0數據處理軟件對同一種植基地采集的30 份不同種植方式下寧夏枸杞不同部位樣品中9 個成分含量進行分析，繪制柱形圖。其中不同部位樣品方差分析采用單因素ANOVA 法，方差齊時用S-N-K 進行兩兩比較，方差不齊時用Games-Howell 進行兩兩比較；不同種植方式樣品方差分析采用獨立樣本t檢驗法。

2.5 不同種植方式下寧夏枸杞不同部位中香豆素類和苯丙酸類成分含量測定

2.5.1 寧夏枸杞不同部位各成分含量 各成分在寧夏枸杞不同部位含量分布差異有統計學意義（圖3），東莨菪內酯、秦皮素、秦皮甲素主要分布于青果和葉片中，其中以東莨菪內酯質量分數最高，為242.33～396.00 μg·g-1，且隨果實成熟其質量分數顯著降低，有機青果中東莨菪內酯（396.00 μg·g-1）質量分數是有機紅果（9.07 μg·g-1）的43.7 倍。秦皮苷、東莨菪苷主要分布于根皮和葉片中，其中東莨菪苷含量最高，質量分數為63.20～460.00 μg·g-1，且隨果實成熟其質量分數顯著降低，有機青果中東莨菪苷（70.07 μg·g-1）的質量分數是有機紅果（0.15 μg·g-1）的467.6 倍。苯丙酸類成分分布規律不一致，咖啡酸主要分布于根皮中，質量分數為11.73～51.23 μg·g-1；阿魏酸和對香豆酸主要分布于果實中，質量分數為11.63～291.00 μg·g-1；綠原酸主要分布于葉片和青果中，質量分數為49.00～1 726.67 μg·g-1。其中2個苯丙酸類化合物（阿魏酸和對香豆酸）在果實中的含量則隨果實成熟而升高，常規紅果中阿魏酸和對香豆酸（質量分數分別為51.20、291.00 μg·g-1）分別比青果（質量分數分別為29.83、11.63 μg·g-1）中質量分數高1.7、25.0倍，差異有統計學意義。

圖3 不同種植方式下寧夏枸杞不同部位中香豆素類和苯丙酸類9個成分質量分數（, n=3）

2.5.2 不同種植方式下寧夏枸杞各成分含量 不同種植方式下寧夏枸杞中香豆素類成分含量整體表現為有機種植高于常規種植，其中東莨菪內酯、秦皮素、東莨菪苷、秦皮苷在青果、中果和葉片中均表現為有機種植時含量高于常規種植。東莨菪苷在根皮中含量及秦皮甲素在葉片中含量也呈現出有機種植顯著高于常規種植的特點。4個苯丙酸類成分在青果和根皮中也表現為有機種植時樣品含量更高的特點，差異均有統計學意義，其他部位中沒有明顯一致性規律。

3 討論

3.1 方法學考察結果

寧夏枸杞次生代謝物質種類眾多，基質復雜，因此快速測定多個化合物具有一定的難度，本研究通過梳理文獻，優化條件，成功建立了一次性定量測定多個物質的方法，且具有快速、穩定、準確的優點。本研究首次定量了寧夏枸杞中的秦皮素、秦皮苷和秦皮甲素，且可以實現東莨菪苷和其同分異構體綠原酸的高效分離，但檢測方法在開發過程中也遇到了一些值得關注的問題：1）東莨菪苷與綠原酸相對分子質量完全相同，且在負離子模式下其質譜碎片、出峰時間完全一致，徐小昆等[38]用高效液相色譜法同時檢測丁公藤屬植物中這2 個成分時出峰時間也非常接近，提示在檢測這2 個成分時應避免相互干擾而出現的假陽性結果。2）已有研究表明，擬南芥在堿性缺鐵環境下根皮會分泌大量東莨菪內酯、東莨菪苷，少量秦皮素、秦皮苷和痕量秦皮甲素，雖然這些成分含量差異較大，但在植物鐵吸收中均有重要作用[9-10,39-40]。本研究雖在寧夏枸杞中檢出秦皮甲素，但其含量較東莨菪內酯與東莨菪苷低2～4 個數量級，屬痕量成分，在檢測時因加入的枸杞提取液基質效應較強，導致本方法中秦皮甲素回收率偏高，但符合《中華人民共和國藥典》2020年版（四部）“9101 分析方法驗證指導原則”中對基質復雜、組分質量分數低于0.01%及多成分等分析的要求，同時建議后續以該物質作為主要研究對象時采用內標法以減輕基質干擾。

3.2 樣品含量測定結果

基于本研究所建立的方法實現了對寧夏枸杞樣品中香豆素類和苯丙酸類成分含量的定量檢測，其中東莨菪內酯和東莨菪苷含量較高，而秦皮素、秦皮苷和秦皮甲素含量非常低，在枸杞這種復雜基質內討論秦皮素、秦皮苷和秦皮甲素的含量差異意義不大。本研究中幾種苯丙酸類成分含量分布無明顯一致性規律，推測這與此類成分不僅為香豆素類成分合成提供前體，還在其他物質合成中扮演重要角色，且自身也具有一定生物活性有關[41]。

寧夏枸杞是藥食同源植物，主要以干燥成熟果實（枸杞子）入藥，深受廣大消費者喜愛。本研究測得中寧縣寧夏枸杞成熟紅果中東莨菪內酯質量分數為48.87 μg·g-1，東莨菪苷質量分數為2.96 μg·g-1，咖啡酸質量分數為4.41 μg·g-1，綠原酸質量分數為26.03 μg·g-1，均低于Jarouche等[28]購自悉尼市場的寧夏枸杞果實（商品）中東莨菪內酯（330.00～2 170.00 μg·g-1）、咖啡酸（0～240.00 μg·g-1）及綠原酸（0～7 150.00 μg·g-1）。與徐飛等[42]采自中寧縣及購自寧夏藥材公司的果實中東莨菪內酯質量分數（27.50～57.30 μg·g-1）一致，而遠低于其測定的東莨菪苷質量分數（59.5～167.6 μg·g-1），推測這可能與果實成熟度有關，或與綠原酸干擾有關，有待進一步研究。

東莨菪內酯為茄科植物的重要植保素[12]，是植物遭受病蟲侵害時產生的一類防御性次生代謝物質，通常積累于植物亟須保護的幼嫩部位，如未成熟的果實中[43-44]。本研究結果顯示青果中東莨菪內酯含量最高，并隨果實成熟含量降低，推測東莨菪內酯是保護枸杞青果免受病蟲侵害的重要植保素物質。

此外，有研究證實植物通常由根系合成香豆素糖苷化合物，傳輸至地上部分以香豆素糖苷形式儲存于細胞液泡中[8]，當植物受到逆境脅迫時液泡中的香豆素糖苷可以快速轉化為香豆素苷元以應對環境脅迫[11]，發揮殺蟲[19]、抗菌[16]等作用。本研究發現常規種植條件下寧夏枸杞根皮中東莨菪苷含量高于東莨菪內酯，而在葉片中東莨菪內酯含量高于東莨菪苷，推測這與枸杞葉片亟須抵抗枸杞木虱、枸杞癭螨、白粉病等病蟲害有關[45]，這與楊孟可等[46]研究發現枸杞癭螨為害后枸杞葉片中東莨菪內酯含量顯著上升的研究結果一致。

有機種植是按照有機標準[47]生產，不使用人工合成的肥料、農藥、生長調節劑等物質，對于容易遭受病蟲為害的寧夏枸杞而言，有機生產方式下，因其營養相對匱乏，病蟲害更加嚴重。本研究顯示，有機種植方式下寧夏枸杞中香豆素類次生物質含量均較高，因此，推測有機種植方式下寧夏枸杞通過根系合成分泌香豆素類成分以提高植株營養吸收能力，并通過提高葉片香豆素類成分含量應對病蟲害。

4 小結

藥用植物的活性成分主要來自于植物逆境脅迫下所產生的次生物質[48]，次生物質種類及其含量通常還決定了藥材的質量及道地性[49]。香豆素類次生代謝物質在植物適應環境中發揮著重要作用[40]，本研究在寧夏枸杞青果、中果、紅果、葉片及根皮中均檢測到多種香豆素類成分，其中以東莨菪內酯及其糖基化合物東莨菪苷含量最高，這與目前植物界香豆素類物質分布規律相符[10-11,50]，此外，東莨菪內酯和東莨菪苷是枸杞子及地骨皮中具有抗癌作用的重要藥理活性成分[25,31,51]，因而本研究結果可以為寧夏枸杞藥用資源綜合開發利用提供參考，同時對深入研究香豆素類等物質在寧夏枸杞環境適應中的生態作用具有重要意義。