黃芩素通過TLR4/NF-κB信號通路對小鼠結腸炎的干預作用

邵曉曉，王偉中，馬國龍，金穎莉，史睿昕，蔣益

1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 消化內科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學 第二臨床醫學院，浙江 溫州 325035

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）確切病因未知[1]，臨床上缺乏特異性、有效的治療藥物。UC患者病情常遷延反復，因此尋找安全有效的治療藥物迫在眉睫。研究證實核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）在UC患者體內呈過度活化狀態，參與UC的發生和發展[2]。Toll樣受體4（Tolllike receptor 4,TLR4）通過外來刺激因子和TLR4結合之后激活固有免疫系統，啟動NF-κB信號通路，導致炎癥反應發生[3]。

黃芩素（分子式C15H10O5）是中藥黃芩的主要有效成分，具有抗炎、抗菌、免疫調節等作用[4]。《傷寒論》認為以黃芩為主藥的黃芩湯有清熱燥濕、和中止痛的作用，近年來研究發現，黃芩湯對治療炎癥性腸病具有較好療效，但機制不明[5]。研究還發現黃芩素能夠通過調節NF-κB的活性達到抗炎效果[6]。因此，本研究通過觀察黃芩素對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium,DSS）誘導的實驗性結腸炎小鼠的治療作用，研究黃芩素是否通過干預TLR4/NF-κB信號通路發揮作用，旨在為黃芩素治療UC提供實驗和理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：黃芩素購自上海Aladdin公司，DSS（相對分子質量36～50 kDa）購自美國MP Biomedicals公司，羥甲基纖維素鈉、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、二脒基苯基吲哚（DAPI）染料購自北京Solarbio公司，RNAsimple總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，PrimeScript反轉錄試劑盒購自美國Roche公司，iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix購自美國Bio-Rad公司。山羊抗小鼠NF-κB p65抗體購自上海Rndsystems公司、兔抗小鼠EPCAm抗體購自美國Affinity公司，驢抗山羊（Alexa Fluor488標記）熒光二抗購自英國Abcam公司，驢抗兔（Cy3標記）熒光二抗購自武漢Servicebio公司。

1.1.2 動物：6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量18～22（21.7±0.16）g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，并在溫州醫科大學SPF級實驗動物中心適應性飼養1周后用于實驗，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2018-0017。小鼠飼養具體環境條件如下：溫度22～25 ℃，相對濕度45%，光照和黑暗環境各12 h循環。本動物實驗研究獲溫州醫科大學實驗動物倫理委員會批準（編號wydw2017-0019）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：將C57BL/6品系小鼠按照隨機數字表法分為5組，即對照組、結腸炎組、黃芩素低劑量（Ba-L）治療組[10 mg/（kg·d）]、黃芩素高劑量（Ba-H）治療組[25 mg/（kg·d）]和5-氨基水楊酸（5-amino-salicylic acid,5-ASA）治療組，每組各12 只。對照組小鼠自由飲用清水，其余小鼠連續7 d自由飲用3.5% DSS溶液，構建實驗性結腸炎模型。藥物劑量和給藥方式參照ZHONG等[7]的方法：在開始飲用DSS溶液7 d前予實驗組小鼠藥物（黃芩素或5-ASA）灌胃連續7 d，在開始飲用DSS溶液后，繼續給予藥物（黃芩素或5-ASA）灌胃7 d，每日灌胃1次，每次0.2 mL。所有藥物均溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中制成混懸液，對照組小鼠連續14 d每日灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液0.2 mL。造模后定期觀測、記錄小鼠的體質量變化、糞便性狀和便血等情況，并評估小鼠疾病活動指數（disease activity index,DAI）[8]。在造模第7天，采用頸椎脫臼法處死小鼠，收集小鼠結腸組織并測量結腸長度，選取距離小鼠肛門1～2 cm處的結腸組織，予以常規組織脫水、石蠟包埋。組織連續切片后予以HE染色，采用組織學活動度評分（histology activity index,HAI）[9]對結腸組織進行病理學評估炎癥程度和組織損傷。

1.2.2 實時熒光定量PCR：檢測小鼠結腸組織中炎癥細胞因子[γ干擾素（interferon-γ,IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）]的水平，反映小鼠腸道炎癥的程度。檢測小鼠結腸組織中TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）、NF-κB p65的相對表達水平，間接反映TLR4/NF-κB信號通路的激活程度。根據RNAsimple總RNA提取試劑盒說明書從小鼠結腸組織中提取總RNA，采用分光光度計檢測RNA濃度、純度，根據PrimeScript反轉錄試劑盒說明書制備cDNA樣品，采用iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix定量PCR檢測。總反應體系10 μL，包括上下游引物各0.4 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，見表1。以標準管家基因（GAPDH）為參照，采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR采用的引物序列

1.2.3 免疫熒光技術檢測腸上皮細胞NF-κB p65入核率：檢測小鼠結腸上皮細胞中NF-κB p65的入核率，評價NF-κB信號通路的激活程度。小鼠結腸組織石蠟切片，經過脫蠟、水化之后，枸櫞酸鈉抗原熱修復，用0.3% Triton X-100破膜15 min。PBS洗滌后，用3% BSA封閉1 h，滴加一抗（山羊抗小鼠NF-κB p65抗體和兔抗小鼠EPCAm抗體），置于濕盒中4 ℃孵育過夜。次日，PBS洗滌后，滴加熒光二抗[驢抗山羊（Alexa Fluor 488 標記）熒光二抗和驢抗兔（Cy3標記）熒光二抗]，室溫避光孵育1 h后，用DAPI復染細胞核。PBS洗滌，滴加自發熒光淬滅劑，予以抗熒光淬滅封片劑封片，將切片放置于熒光顯微鏡下觀測并采集相應圖像。采用Image Pro Plus 6.0（IPP）圖像分析軟件對所得圖像進行定量分析。DAPI染色標記細胞核，EPCAm抗體標記小鼠結腸上皮細胞，NF-κB p65抗體標記p65蛋白，在高倍鏡視野下，統計腸上皮細胞中p65的入核率。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS26.0統計處理軟件分析數據。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗（方差齊）或Tamhane’s T2檢驗（方差不齊）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠結腸炎嚴重程度評估 在整個實驗過程中，對照組小鼠無腹瀉和便血等癥狀，總體精神狀態良好，體質量輕微上升；其余4組小鼠均在飲用3.5% DSS溶液后的第3天開始出現體質量下降、腹瀉、便血等表現。在第7天時，結腸炎組小鼠體質量和小鼠結腸長度都明顯低于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.01）；而Ba-L治療組、Ba-H治療組以及5-ASA治療組小鼠體質量和結腸長度均明顯高于結腸炎組，差異有統計學意義（均P＜0.01），見圖1。各治療組小鼠體質量變化率差異無統計學意義（均P＞0.05）；而Ba-L治療組小鼠結腸長度顯著短于5-ASA治療組，差異有統計學意義（P＜0.01）。造模第7天時，Ba-L治療組、Ba-H治療組以及5-ASA治療組小鼠DAI均顯著低于結腸炎組小鼠，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖1；HAI評分均顯著低于結腸炎組，差異有統計學意義（均P＜0.01）；光鏡下表現為隱窩結構更加完整，黏膜潰瘍面積更小，炎性細胞浸潤更少，見圖2、圖3。

2.2 小鼠炎性細胞因子相關mRNA相對表達水平結腸炎組小鼠的結腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平明顯高于對照組小鼠，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。Ba-H治療組結腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平顯著低于結腸炎組小鼠，差異有統計學意義（均P＜0.01）。3個治療組間比較，這些炎性細胞因子mRNA表達水平差異無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

2.3 TLR4/NF-κB信號通路相關mRNA相對表達水平結腸炎組小鼠結腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均高于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.01）。Ba-L治療組、Ba-H治療組和5-ASA治療組小鼠結腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均低于結腸炎組，差異有統計學意義（均P＜0.05）；各治療組之間上述指標表達差異無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠結腸組織mRNA相對表達量（每組n=12，）

表2 各組小鼠結腸組織mRNA相對表達量（每組n=12，）

與對照組比：aP ＜0.01；與結腸炎組比：bP ＜0.05，cP ＜0.01

2.4 免疫熒光檢測腸上皮細胞中NF-κB p65的入核率 結腸炎組腸上皮細胞中NF-κB p65的入核率顯著高于對照組小鼠，差異有統計學意義（P＜0.01）。Ba-L治療組、Ba-H治療組以及5-ASA治療組的腸上皮細胞中NF-κB p65的入核率均顯著低于結腸炎組，差異有統計學意義（均P＜0.01），見圖4。

3 討論

西醫理論認為UC是遺傳、免疫、環境、微生物等因素綜合作用于遺傳易感者，使機體產生異常免疫反應，最終導致腸組織炎癥性損傷[10]。祖國傳統醫學將UC歸屬于“赤沃”“泄瀉”“久痢”等疾病范疇[11]。目前UC仍缺乏特異性治療藥物，而祖國傳統醫藥對于治療胃腸道慢性疾病常顯示出獨到的療效。現代藥理學研究表明，提取自中藥黃芩的黃芩素具有抗感染、調節免疫等藥理作用，參與調節多種炎癥信號通路，兼具高效、無毒、經濟等優點，有望成為治療UC的潛在藥物。

本研究發現小鼠飲用3.5%的DSS溶液后會出現明顯的急性結腸炎表現，如嚴重的腹瀉、便血、體質量下降、結腸短縮等，這與既往的報道基本相符[8]。5-ASA作為經典的UC治療藥物，被多項動物研究用于治療DSS誘導的急性結腸炎，并具備一定的療效。本研究發現，口服黃芩素和5-ASA能夠顯著改善結腸炎小鼠的腸道炎癥，增加小鼠體質量及結腸長度，降低DAI和HAI評分。本研究還發現，結腸炎組小鼠較對照組結腸黏膜結構破壞嚴重，出現的腸道潰瘍更大，炎性細胞浸潤數目更多、程度更深、范圍更廣，且結腸炎組小鼠的結腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β及MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA表達水平明顯高于對照組小鼠。本研究還發現Ba-H治療組結腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平顯著低于結腸炎組小鼠，且Ba-L治療組、Ba-H治療組和5-ASA治療組小鼠結腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平亦均低于結腸炎組，但Ba-L治療組、Ba-H治療組和5-ASA治療組間上述炎性細胞因子和TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白的mRNA表達水平差異無統計學意義。上述研究結果提示黃芩素和經典藥物5-ASA在該模型中顯示出相似的治療效果，各治療組間DAI、HAI以及結腸炎癥細胞因子水平差異均無統計學意義。

在UC的發病過程中，腸上皮細胞和單核巨噬細胞中異常激活的TLR4/NF-κB信號是重要的炎癥啟動因素，會導致大量炎癥細胞因子的釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等，最終引起不可逆的腸道炎癥反應[12]。多項研究發現，黃芩素可通過抑制NF-κB信號在多種炎癥性疾病中發揮作用。WANG等[13]研究發現黃芩素可以通過抑制NF-κB信號通路抑制炎癥反應進程，在阻塞性腎病過程中發揮抗纖維化效應。研究還發現，黃芩素可能通過抑制NF-κB信號通路緩解小鼠腸缺血/再灌注導致的急性肺損傷[14]。黃芩素還可能抑制哮喘的免疫-過敏-炎癥反應而有望成為治療哮喘的新型候選藥物[15]。此外，HE等[16]發現黃芩素能通過抑制NF-κB活化緩解脂多糖誘導的急性乳腺炎。本研究不僅發現各治療組小鼠結腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均低于結腸炎組，而且進一步研究發現結腸炎組小鼠結腸組織中腸上皮細胞中NF-κB的入核率均高于對照組，5-ASA治療組、Ba-L治療組及Ba-H治療組的結腸組織中腸上皮細胞中NF-κB的入核率均低于結腸炎組。目前黃芩素對于結腸炎的治療作用也開始逐漸受到重視。李敏瑤等[17]研究提示黃芩湯中的黃酮類化合物可能通過調節炎癥通路在UC治療中發揮重要作用。王繼森等[18]在研究黃芩湯對UC大鼠的作用中發現其有效成分通過降低細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平抑制實驗性結腸炎大鼠的腸道炎癥。研究還發現黃芩素不僅可以修復結腸炎小鼠的結腸組織黏膜屏障，還可以通過抑制NF-κB的活性，下調炎癥因子的表達而達到抗炎效應[19]。

本研究結果和上述學者的研究共同提示，黃芩素可能通過TLR4/NF-κB信號通路抑制小鼠結腸炎。

本研究發現，黃芩素可能通過TLR4/NF-κB信號通路抑制DSS誘導的結腸炎癥。本研究中黃芩素在對小鼠的治療中發揮顯著的抑炎作用，并且黃芩素相較于傳統的5-ASA制劑具有安全、無毒等優勢，未來可能在UC的臨床治療中發揮潛在的應用價值。