供體巨噬細胞在心臟移植中的研究進展

陳遠洋 王志維

(武漢大學人民醫院心血管外科，湖北 武漢 430000)

近期研究表明，中國年齡≥35歲的居民心力衰竭(心衰)患病率為1.3%，即大約有1 370萬人患心衰。上一次中國全國性的心衰流行病學調查是2000年，當時的調查結果[1]顯示，在35～74歲的人群中，慢性心衰的患病率為0.9%，男性和女性心衰患病率分別為0.7%和1.0%。自從1967年第一例心臟移植手術成功以來，心臟移植一直是心衰晚期患者的最佳治療方法。由于心臟移植的需求不斷增加，如何擴大供體器官庫和增強免疫相容性已成為心臟移植亟需解決的問題[2]。

當前對于移植后免疫抑制的策略是總體上抑制受體的全身免疫反應，這會直接導致許多并發癥的發生。如何平衡同種異體移植保護及防止感染和惡性腫瘤的發生是一個極具挑戰性的問題[3]。之前的研究結果表明在臨床上需探索更好的替代方案，在減少排斥反應的同時也能提高同種異體移植存活率。

最近研究發現，巨噬細胞具有不同的發育起源，由不同的細胞類型組成。已有一些研究[4]調查了巨噬細胞在實體器官移植中的作用。巨噬細胞在誘導同種異體移植損傷和促進同種異體移植存活中具有矛盾作用，這些相反的功能反映了單核細胞和巨噬細胞的復雜和動態變化。心臟內的巨噬細胞可最初分為組織常駐巨噬細胞和浸潤單核細胞衍生的巨噬細胞。在移植的情況下，巨噬細胞的分群極有討論的意義，因為組織常駐巨噬細胞和單核細胞衍生的巨噬細胞分別來自供體和受體。現全面討論心臟組織常駐巨噬細胞的組成，分析討論組織常駐巨噬細胞的功能，并強調組織常駐巨噬細胞在同種異體移植排斥和耐受中已知和推測性的作用。

1 心臟移植后的巨噬細胞種群及其功能

心臟包含不同的巨噬細胞種群，其起源和功能不同。根據CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2，CCR2)的表達，來區分出心臟組織中的巨噬細胞。在正常條件下，成人心臟主要含有CCR2+MHCⅡ+巨噬細胞、CCR2-MHCⅡ+巨噬細胞以及CCR2-MHCⅡ-巨噬細胞[5]。單核細胞與心臟巨噬細胞的不同在于，其表面的CCR2高表達和MHCⅡ低表達，并且缺乏Mer受體酪氨酸激酶。CCR2-巨噬細胞來源于胚胎造血祖細胞，在胎兒發育過程中植入心臟，壽命長，并且在整個過程中都與單核細胞輸入無關，通過局部擴散來維持發展。CCR2-巨噬細胞可通過分泌白介素(interleukin，IL)-10和轉化生長因子-β來促進冠狀血管生成，心肌細胞增殖，并且CCR2-巨噬細胞能抑制中性粒細胞和單核細胞募集[6]。CCR2+巨噬細胞來自循環單核細胞，定位于心臟，并通過逐漸募集單核細胞和局部增殖而得以維持。CCR2+巨噬細胞可促進中性粒細胞和單核細胞募集。消除CCR2+巨噬細胞可減少心肌梗死后的梗死面積和不良的心臟重構。

移植的心臟包含由供體來源的CCR2+和CCR2-巨噬細胞以及受體來源的嗜中性粒細胞、單核細胞、單核細胞衍生的巨噬細胞和單核細胞衍生的樹突狀細胞。經典的受體單核細胞來自血液中游離的單核細胞，并分化為巨噬細胞和樹突狀細胞，將促進免疫排斥反應。在鼠模型中，可使用細胞追蹤技術、同基因(CD45.1/CD45.2)或分子標志技術，將供體與受體細胞分開。通過分析性別或等位基因HLA表達，也有可能在人類中區分供體和受體免疫細胞。例如，分析心內膜活檢樣本(移植后平均8.8年，無主動排斥反應，同種異體移植功能正常)，在女性供體被移植到男性受體中，供體與受體的起源是基于“Y”染色體的存在或不存在[7]。結合原位雜交和免疫染色揭示了很小比例的CCR2-巨噬細胞(<2%)中存在Y染色體。相反，在30%的CCR2+巨噬細胞中檢測到Y染色體，表明心臟CCR2+巨噬細胞代表了供體和受體衍生細胞的集合。關于供體和受體來源的CCR2+巨噬細胞在人類功能上是否有所不同所知甚少[8]。但小鼠研究表明，與供體來源的CCR2+巨噬細胞相比，受體來源的CCR2+巨噬細胞表達較高水平的炎癥趨化因子(CXCL11、CXCL2、CCL2、CCL7和CCL19)、細胞因子(IL-1β和IL-10)和不良的心臟重構基因(AREG、EREG和GDF3)[9]。供體來源的CCR2+巨噬細胞則表達更高水平的干擾素反應基因。總之，駐留在供體心臟內的巨噬細胞存在于移植物中的時間較長，且供體巨噬細胞構成及功能具有獨特性，可能有助于同種異體移植的存活及預后。

2 供體巨噬細胞在缺血再灌注損傷和原發性移植物功能障礙中的作用

器官移植過程中的一個關鍵目標是最大程度地縮短缺血時間，缺血時間與心臟移植后的臨床結果緊密相關。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)被認為是原發性移植物功能障礙的主要誘因，是早期同種異體移植物功能喪失及死亡的主要原因。最近，器官共享聯合網絡修改了心臟供體的分配系統，以促進更廣泛的器官共享并增加對患病個體的分配[10]。盡管尚無全面數據，但由于供體和移植中心間的距離增加，會明顯延長同種異體移植的缺血時間。

已有研究[11]觀察到心肌細胞死亡是由于受體大量中性粒細胞、單核細胞和單核細胞衍生的巨噬細胞浸潤到供體心臟中。此外，IRI后駐留在供體心臟內的巨噬細胞群會調節移植物的炎癥發生和發展。移植后，供體心臟中駐留的CCR2+巨噬細胞的消耗減少，導致受體中性粒細胞外滲減少和單核細胞募集到心臟中[11]。在這種情況下，供體CCR2+巨噬細胞通過Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)9和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴性機制調控中性粒細胞和單核細胞趨化因子的生成來控制受體白細胞募集。相反，來自供體心臟的組織駐留CCR2-巨噬細胞的耗竭導致受體中性粒細胞、單核細胞和單核細胞衍生的巨噬細胞募集顯著增加。這些研究結果顯示供體巨噬細胞在IRI后同種異體移植炎癥中的重要性，在移植前對供體巨噬細胞進行預處理可改善IRI相關的同種異體移植損傷，并降低原發性移植物功能障礙的發生率和嚴重程度[12]。

那么供體巨噬細胞是如何改善IRI及免疫排斥的呢？首先，從損傷或瀕死的細胞中釋放損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)和警報蛋白被認為是將IRI與免疫細胞活化聯系起來的信號。細胞壞死和鐵死亡是DAMP和警報蛋白釋放后引起細胞死亡的主要形式，雖然之前認為壞死主要與同種異體移植免疫細胞的活化有關，但越來越多的證據表明，IRI后繼發的心肌細胞和心肌成纖維細胞死亡的最初原因是鐵死亡。用ferrostatin-1(鐵死亡的特異性抑制劑)治療供體心臟可顯著減少初始心肌細胞和成纖維細胞死亡，并抑制早期中性粒細胞移植物的浸潤[13]。

由肥大性心肌細胞和成纖維細胞釋放的DAMP/警告蛋白的確切作用仍未明確，但可能與TLR結合相關。供體內皮細胞中TLR4的缺失可防止嗜中性粒細胞黏附于靜脈內皮細胞，這是嗜中性粒細胞外滲的關鍵上游步驟。在供體巨噬細胞中消除TLR9和MyD88不會影響嗜中性粒細胞對內皮細胞的最初黏附，但會導致其跨內皮遷移能力受損[14]。這些發現顯示了通過死于心肌細胞釋放的DAMP/警告蛋白，向多種供體駐留細胞類型(包括內皮細胞和巨噬細胞)發出信號，并引發同種異體移植炎癥的可能性。需進一步的研究來揭示IRI誘導的同種異體移植炎癥和同種異體移植功能障礙的信號傳導機制。

3 供體巨噬細胞和同種異體排斥反應及移植耐受性

考慮到巨噬細胞能長久駐留在移植后的心臟中，因此供體巨噬細胞可能促進同種異體移植排斥。越來越多的研究[15]表明，巨噬細胞在急性細胞性排斥反應(acute cellular rejection，ACR)和抗體介導的排斥反應(antibody-mediated rejection，AMR)中均有重要作用。在ACR中，巨噬細胞通過細胞因子和活性氧的產生來促進移植物損傷和心肌纖維化。CD16+單核細胞被認為是促進腫瘤壞死因子-α和IL-1β表達升高的強刺激因素。與浸潤性單核細胞的升高一致，觀察到循環中的CD16+單核細胞中HLA-DR和CD54的表達增加，表明其活化狀態具有增加的遷徙潛力[16]。盡管認識到在ACR期間巨噬細胞會積累在同種異體移植物中，但對巨噬細胞亞群及其起源尚未了解。AMR的標志是嗜中性粒細胞和巨噬細胞在血管周圍和血管內的蓄積，臨床診斷是根據血管內CD68+單核細胞/巨噬細胞的組織病理學來確定[17]。巨噬細胞在急性AMR中導致心臟同種異體移植的損傷，主要表現為促炎表型的血管內單核細胞/巨噬細胞促進抗原加工/呈遞，細胞因子產生和組織重塑。

移植免疫學的金標準是移植接受度或耐受性。目前免疫耐受性主要針對T淋巴細胞(T細胞)，因其在移植排斥中的重要作用，但亦有大量證據表明巨噬細胞亞群有助于免疫耐受。Braza等[18]的研究結果表明，移植物會大量浸潤巨噬細胞表達模式識別受體Dectin-1和TLR4(響應DAMP)，當敲除對應蛋白的基因后，可降低受體炎性巨噬細胞的數量，并促進移植耐受性。同時在該模型中，需通過抑制CD40(T細胞受體)的共同阻斷來誘導長期耐受，這表明T細胞可能會調節巨噬細胞表型。

有研究[19]表明，供體單核細胞和巨噬細胞中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的敲除可增加移植物中Foxp3+調節性T細胞數量，同時增加同種異體移植物的存活時間以及減少心肌或血管損傷。Braza等[18]使用高密度脂蛋白納米生物學靶向mTOR靶標(mTOR-HDL)，能更選擇性地靶向髓樣細胞并抑制T細胞增殖，誘導免疫耐受性的Foxp3+調節性T細胞增殖，并能促進產生耐受型巨噬細胞。從機制上講，mTOR缺陷的移植物浸潤巨噬細胞上調程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)，而PD-L1上調阻止了移植物的急性排斥。盡管這些發現確定了單核細胞和巨噬細胞在建立同種異體移植耐受中的作用，但供體巨噬細胞的確切作用仍有待闡明。

4 供體巨噬細胞作為治療目標

很少有研究表明減少巨噬細胞活化或抑制其效應機制可減輕IRI和排斥反應并提高同種異體移植的存活率。盡管在供體和受體來源的巨噬細胞的確切功能方面存在很大差異，但研究數據確實表明，操縱供體巨噬細胞亞群可證明是有效的。如果確實必須將供體亞群作為靶標，那么CCR2+巨噬細胞將成為心臟移植的首選靶標[20-21]。這些炎性細胞可被靶向短肽的納米顆粒、標準單克隆抗體(即MLN1202)或新型構建體(如雙特異性或多特異性抗體)靶向治療，這些試劑可通過效應T細胞或自然殺傷細胞活化來促進消除炎性細胞[22-23]。此外，它們還可用于抑制特定細胞類型(如供體CCR2+巨噬細胞)上的細胞信號傳導。

開發在移植前直接用于供體器官的療法(在冷藏或常溫灌注過程中)具有巨大的研究前景。此類藥物可將與全身免疫抑制有關的風險降至最低，包括威脅生命的感染和惡性腫瘤[24]。針對引發同種異體移植炎癥和排斥的浸潤性單核細胞和巨噬細胞的靶向應用治療方法，可能比目前阻止下游炎癥機制的方法更具優勢。

5 結論與展望

從IRI到同種異體移植排斥和耐受，巨噬細胞涉及移植的許多方面。在過去的幾年中，范式轉換研究提供了關于巨噬細胞多樣性和功能重要性的研究證據。如今正在探索供體巨噬細胞與受體單核細胞和單核細胞衍生巨噬細胞之間的差異作用和相互作用。這些研究提出了在移植前靶向供體巨噬細胞可能是改善移植結果途徑的可能性。靶向供體巨噬細胞需全面了解供體和受體巨噬細胞在同種異體移植整個生命周期中的作用。在這一領域，認識還存在很大局限，要解決的關鍵問題包括：不同的心臟巨噬細胞亞群在排斥和長期同種異體移植耐受中的作用；介導心臟巨噬細胞激活和單核細胞分化的機制；供體和募集的單核巨噬細胞如何相互作用；免疫系統是否會影響移植結果。解決這些問題將為安全有效的免疫抑制帶來新的希望和目標。