絲素蛋白復合水凝膠于腫瘤治療的研究進展

鄭法康, 龔海東, 王 闖, 紀文陽, 李金庫, 李祿榮

(1.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院 神經外科,黑龍江 牡丹江 157000; 2.高州市人民醫院 神經外科,廣東 高州 525200)

腫瘤的發病率逐年上升,嚴重威脅著人類的健康,自1845年系統地報道了第一例惡性腫瘤病例開始,到最近幾十年,人們才逐漸對癌癥相關的生物學和病理學有了深入的研究[1-2]。2021年美國預計新發癌癥病例將達1 898 160例[3]。絲素蛋白(Silk fibroin,SF)是美國食品藥品監督管理局批準的天然高分子材料,由于在生物醫學工程方面表現出杰出的優點,使其受到科研人員的廣泛關注[4]。在探索腫瘤治療方法的過程中,局部化療已被歸為惡性腫瘤的常規治療方法[5-6]。SF水凝膠結合化療藥物在腫瘤局部化療方面具有重要意義,它能夠在相對較長的時間內保持腫瘤原位的高藥物濃度,同時具有藥物載體、藥物緩釋及非手術輸送藥物等優點[7]。本文簡要介紹了SF水凝膠的特點,包括SF水凝膠的性質、腫瘤相關應用和前景,并探討了近年來SF水凝膠載藥在抗腫瘤方面的研究進展,以期拓寬SF水凝膠的應用范圍。

1 SF及SF水凝膠的性質

SF是家蠶蠶絲經脫膠得到的天然結構性蛋白(圖1)[8],由多肽重鏈(350 kDa),多肽輕鏈(25 kDa)和糖蛋白P25組成,具有α-螺旋和無規卷曲的二級結構,呈水溶性,且生物相容性、穩定性較高[9]。由于SF有豐富的β-折疊結構,可在體內通過酶降解和非酶降解,這保證其杰出的機械性能和生物降解性,使這種天然蛋白質已成為實驗模型及生物納米技術可調設計的良好藥物載體[10-11]。水凝膠具有高分子電解質特性和三維聚合物網絡,它能夠在保持其結構完整性的同時吸收大量水分,SF水凝膠是可以模擬生物軟組織性質的一類先進材料形式[12]。SF水凝膠具有無毒性、非免疫原性、藥物緩釋特性及局部可注射性,且可作為藥物載體持續釋放藥物[13-15]。Lovett M L等[16]使用SF水凝膠作為載體,在體外和體內注射SF水凝膠負載貝伐單抗制劑,釋放曲線顯示可持續釋放3個月以上,并且在3個月后具有生物降解的跡象。由于其藥代動力學和生物降解特性,該給藥系統可減少藥物的給藥頻率。

2 SF復合水凝膠成膠方式

水凝膠能夠模擬組織細胞外間質組成,在組織工程應用中被大量用作人工基質。SF水凝膠通過與某種物質交聯后,再通過物理或化學方法促進其形成SF復合水凝膠,得到的SF復合水凝膠較單純的SF水凝膠因復合物不同,使得其在某方面性能更具有優勢,這表明SF水凝膠具有杰出的可利用性和可塑性。研究發現,絲素溶液的凝膠化基本是由β-折疊轉變引起的,除電場誘導的SF水凝膠是轉變為α-螺旋外,與絲素溶液相比SF凝膠中的β-折疊或α-螺旋含量更高,增加β-折疊或α-螺旋含量可加快凝膠速度[17-18]。SF可經過物理或化學方法誘導其凝膠化,物理方法主要是溫度、剪切力、超聲波、電場,其中溫度及剪切力是從分子層面加速凝膠,分別是增加分子之間的碰撞和促進分子間相互作用,而超聲波則是通過局部區域極端壓力和溫度導致凝膠化和聚集,同樣在SF溶液中施加電場會導致局部pH值降低,進而導致絲素蛋白聚集凝膠化[19-21]。

化學誘導凝膠化相對物理誘導可供選擇的方案較多,主要包括表面活性劑、小型中性添加劑、酸堿度、化學交聯、化學偶聯、聚合物試劑、有機試劑(醇類等)、鹽類、高壓一氧化碳,其中使用表面活性劑進行化學誘導可以產生機械性能良好、穩定的SF水凝膠[22];使用小型中性添加劑(如甘油等)誘導SF水凝膠,可減少SF水凝膠的凝膠化時間,目前已應用在生物醫學方面[23];通過實驗證明酸堿度的調定對SF溶液凝膠化有直接影響,特別是pH值在3.8～3.9處時,可加速形成穩定的SF水凝膠,這是由于在靠近其等電點的pH值可以誘導蛋白質沉淀[24];化學交聯劑(如過氧化氫和辣根過氧化物酶等)可用于共價交聯上酪氨酸殘基的酚基而形成高彈性SF水凝膠[25],同樣化學偶聯也是在酪氨酸殘基上進行修飾,從而調節疏水和親水性質,這種方法能夠在短短的5 min至2 h內快速產生受控的SF水凝膠[26]。因此SF水凝膠可以通過不同的凝膠方式,來加強某一特殊的性能,也常常與多種材料復合,被加工成特性不同的藥物載體,使其從組織工程到生物醫學甚至神經傳感上都得到廣泛的應用。

3 SF水凝膠在腫瘤方面的應用

3.1 對于腫瘤體外模型方面的應用

SF水凝膠易于被修飾,因為其有從水溶液或有機溶劑中加工成多種材料形式的能力,使其成為當下研究的熱點之一。Ribeiro V P等[18]用辣根過氧化物酶交聯反應形成SF水凝膠,其構象由無規則卷曲變化為β-折疊,將膠質母細胞瘤包封在SF水凝膠中進行實驗。該研究利用快速反應的SF水凝膠作為三維體外腫瘤模型,為研究腫瘤細胞程序性死亡的微環境提供了有力的工具。Carvalho M R等[27]用辣根過氧化物酶交聯SF溶液形成3D體外動態模型模擬體外類瘤環境,并用直腸癌細胞證明此3D模型能夠精確地可視化觀察癌細胞遷移,且可通過改變模型微環境,觀察癌細胞的行為改變。Kundu B等[28]用SF和結冷膠通過調節適合的比例形成水凝膠,模擬骨肉瘤體外模型,并通過實驗驗證脂肪來源干細胞對骨肉瘤細胞三維球狀體模型的作用。體外3D模型的建立是體外癌細胞系培養和體內腫瘤之間的中間模型,對于醫學發展具有重要意義。

3.2 SF水凝膠在各腫瘤方面的應用

SF水凝膠是一種很有開發潛能的材料。近年來,SF水凝膠以其優異的生物相容性、可控制的體內降解性和可調節的力學性能在藥物輸送中的應用受到了廣泛關注。通過物理或化學處理方式及與其他生物材料復合制備出不同功能的載藥SF水凝膠,在各系統腫瘤的研究和應用中取得了良好的成果(圖2)。

3.2.1 SF水凝膠在膠質母細胞瘤方面的應用

膠質瘤是中樞神經系統中發病率、惡性程度最高的腫瘤,膠質母細胞瘤(Glioblastoma,GBM)預后極差,其中位生存期約15個月,5年生存率不足10%,原位小范圍復發率極高[29-31]。其治療主要以手術治療為主,放化療為輔,但由于血腦屏障化療效果較差,而局部原位治療不但可以克服血腦屏障,而且能提高藥物利用率、降低藥物副作用對人體的傷害。SF水凝膠其惰性和無免疫原性、易于裝載多種治療劑和釋藥可控性等特點,成為一種潛在的藥物輸送的優質生物材料。有實驗將SF水凝膠植入小鼠尾狀核,通過電生理等實驗證明腦組織對SF水凝膠有良好的生物相容性及耐受力。術中或超早期的術后局部原位治療,可填補GBM術后放化療標準治療策略中1個月的傷口愈合空白期,增加腫瘤治療的連續性。Yao Q等[32]研究中將SF水凝膠與膽綠素聯合形成雙功能水凝膠,通過注射到裸鼠的皮下膠質瘤腫瘤模型中表明,SF水凝膠不但能響應近紅外照射在腫瘤局部產熱,防止光吸收劑的泄漏損害鄰近組織,同時還發揮抗炎作用,刺激血管生成和傷口愈合。高級別膠質瘤術后病人中,大多數具有神經功能障礙,目前修復中樞神經系統的有效療法尚不存在。Gisbert Roca F等[33]將透明質酸(Hyaluronic acid,HA)和SF結合,發現結合SF可以改善HA的力學和生物學性能,可以成為有效的生物相容性神經導管。雖然目前還沒有明確其可否用于腫瘤術后神經纖維束的修復,但基于干細胞的神經纖維順上修復療法已被廣泛應用于腦損傷的動物模型,一些臨床實驗也證實了其有效性[34-36]。綜上,SF水凝膠具有藥物載體和保護修復腦組織的性能,在局部原位化療方面有重要的地位,是優異的媒介,SF水凝膠作為局部原位治療的藥物載體已經成為一個重要的趨勢,且對于術后復發、腫瘤部位較深,越過或達到對側胼胝體膠質母細胞腫瘤治療有重要意義。

3.2.2 SF水凝膠在乳腺癌方面的應用

乳腺癌是2020年女性癌癥特異性死亡的主要原因之一。目前在乳腺癌的研究中,雖然有大量的實驗通過預測和評估預后的標記物來決定是否支持化學治療[37-38],但當下化療仍然是預后不良患者的主要治療措施之一[39],尋找新的治療策略是非常急迫的。Laomeephol C等[40]用二肉豆蔻酰甘油磷酸甘油(Dimyristoyl glycerol phosphate glycerol,DMPG)為基礎的脂質體包封抗癌藥物姜黃素,并且通過DMPG的疏水區和SF鏈相互作用快速凝膠化,形成載藥復合體,用乳腺癌細胞進行體外評價脂質體-姜黃素-SF復合水凝膠的抗腫瘤能力,實驗證明水凝膠中緩慢釋放的姜黃素可以持續抑制細胞生長。三陰性乳腺癌具有復發率高、侵襲力強、轉移能力強等特點,已被臨床公認為最需要治愈的惡性乳腺癌類型[41-42]。Wang H等[43]利用聚多巴胺交聯膠原/絲素復合水凝膠,凝血酶通過互補寡核苷酸被裝載到水凝膠中,形成了一種具有光響應性的可注射水凝膠。在近紅外光存在的情況下,水凝膠可以吸收近紅外光并將其轉化為熱,不僅可以觸發凝血酶的釋放,將鎖定的凝血酶被釋放到鄰近組織的血管中,以促進血液凝固,還可以減少促進血管生成的信號分子的分泌,減少血管內皮細胞生長因子的分泌,從而阻止鄰近組織的血管生成。體內外實驗結果表明,通過阻斷腫瘤周圍血管、阻止血管生成,這種營養剝奪策略能有效地預防三陰性乳腺癌復發和轉移。Gou S Q等[44]開發出一種負載阿霉素和熒光素Cy7的SF水凝膠,展示出了集合化療、光熱、光動力療法為一體的SF復合水凝膠,在體內小鼠乳腺癌模型實驗中展示出強大的抗腫瘤效果。因此,這種可注射水凝膠具有很大的潛力,可以作為一種天然的多反應藥物釋放系統,用于協同治療腫瘤。SF通過各種修飾負載藥物形成一種可注射水凝膠,以微創的給藥途徑在局部有限的空間內給藥,且具有觸變性和凝膠形成特性,是一種很有前途的局部治療腫瘤的策略。

3.2.3 SF水凝膠在肝癌方面的應用

肝癌的發病率逐年上升,是癌癥相關死亡的主要原因之一[45-46]。Cao H等[47]將絲素蛋白和羥丙基纖維素兩種天然聚合物合成水凝膠,同時裝載親水性藥物阿霉素和疏水性藥物姜黃素,利用姜黃素與水凝膠中β-折疊區域的相互特異性作用,極大地提高了疏水姜黃素的溶解度和穩定性,使其展現出更好生物利用度。裝載雙藥的水凝膠較游離藥物和阿霉素單一載藥水凝膠在肝癌小鼠模型上顯示出更好的長期持續抗腫瘤效果,裝載雙藥水凝膠具有較好的治療效果和逆轉多藥耐藥的作用。Wu P Y等[48]用SF水凝膠裝載SF納米粒子包封的鹽霉素和紫杉醇,可同時殺死腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞,在小鼠皮下肝癌腫瘤模型中較單一給藥與傳統給藥方式相比表現出明顯的抑制腫瘤生長作用。這種納米顆粒復合水凝膠可以連續緩釋藥物達30 d以上,作為抗腫瘤藥物釋放平臺無疑對于防止腫瘤復發和轉移十分有利。Qian K Y等[49]開發了一種以SF和氧化鐵納米立方體離子(Iron oxide nanocubes,IONCs)為基礎合成的可注射亞鐵磁性絲素水凝膠,應用在兔肝癌的治療,其治療效果與光熱治療相比,嵌入式IONCs賦予亞鐵磁性與遠程高熱SF水凝膠之間存在一個交變磁場,導致深部腫瘤的有效磁高熱性能增強。此外,由于SF水凝膠中離子的限制,與直接給予單分散磁性納米粒子相比,可以避免對正常組織的熱損傷。這些結果表明,亞鐵磁性絲素水凝膠可以通過超聲引導的介入性磁熱治療在更深的位置治療腫瘤。保玉[50]制備了絲素蛋白和明膠的水凝膠,并用京尼平交聯明膠提升水凝膠的力學性裝載青蒿素進行動物實驗,結果表明,15 d內載藥復合水凝膠能夠顯著抑制腫瘤的生長,且對裸鼠的正常生長沒有毒副作用。SF水凝膠載藥是實體腫瘤手術切除后局部應用于腔內的潛在給藥系統,有望成為一種新的、強大的局部抗腫瘤治療的方案。

3.2.4 SF水凝膠在胃癌方面的應用

藤黃酸(Gambogic acid,GA)對胃癌有抑制作用,但藤黃酸具有溶解度差、非特異性生物分布、有毒性、半衰期短等缺點,在實際應用中受到了極大限制。Zhang D H等[51]研發了一種由羥丙基纖維素、SF和甘油組成的可注射水熱敏凝膠,實驗采用此水凝膠包封藤黃酸納米顆粒和腫瘤穿透肽,用甘油調節水凝膠的凝膠時間和微孔大小,使其具備良好的兼容性和持續釋放特性,水凝膠構建的腫瘤穿透肽和藤黃酸納米顆粒具有顯著的抗腫瘤作用,其作用與保留藥效、局部給藥和持續釋放腫瘤穿透肽促進納米顆粒滲透到腫瘤的深部有關。Gangrade A等[52]用SF水凝膠和抗癌藥順鉑納米顆粒復合注射絲素水凝膠,在體外胃癌模型中展現出了明顯的抗癌效果,且SF復合水凝膠呈剪切變稀特性,黏度隨著剪切應變的增加而降低,由于其具有剪切稀釋性,絲素水凝膠可以很容易地注射到疾病部位,在那里它可以作為藥物持續釋放的儲存庫,展現出了優異的可注射性。局部給藥方法是為了防止腫瘤的復發,并抑制其擴散到附近的健康組織,這是目前正在實施的全身靜脈給藥方法的一種替代方法,其中需要一個倉庫來局部限制藥物在病變部位的位置,以防止癌癥復發并抑制其擴散到附近的健康組織。

3.2.5 SF水凝膠在骨腫瘤方面的應用

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發性惡性骨癌[53]。如今,骨肉瘤的治療包括手術和化療方案,但有約30%的患者對化療有耐藥性,最終腫瘤發生轉移,使得患者預后并沒有得到明顯改善[54]。水凝膠有優異的機械性能能夠模擬組織的細胞外基質成分,廣泛應用于組織工程。Yu Q W等[55]將SF和透明質酸甲基丙烯酸酯化形成水凝膠,裝載殼聚糖納米顆粒包封的姜黃素,用于骨肉瘤治療和促進骨組織再生,并且用乙醇增加水凝膠中β-折疊的含量,以增加復合水凝膠的機械性能,且在pH值小于6時姜黃素表面的可電離氨基被質子化,使殼聚糖成為陽離子聚電解質。隨后,由于聚合物鏈的排斥,殼聚糖開始膨脹,使姜黃素的釋放速度加快,表現出pH值響應性釋放姜黃素,使其在血液中更安全(pH值7.4),在腫瘤部位(pH值4～6)更有效地釋放。此外,裝載姜黃素的復合水凝膠在體外能明顯促進小鼠胚胎成骨細胞的增殖。Pierantoni L等[56]報道了以過氧化鈣為底物用辣根過氧化物酶交聯SF水凝膠,結果表明,含鈣SF水凝膠可作新的原位療法用于骨癌治療,尤其是在骨肉瘤治療方面展現出極大的潛力。總之,SF水凝膠展示出了優越的物理性質、易于修飾的同時,自身結構穩定的性質及強大的膨脹比有利于水凝膠與組織的黏附等多重功能。

3.2.6 SF水凝膠在其他腫瘤方面的影響

SF水凝膠本身具有良好的生物穩定性,與其他化學物質結合依然能夠保持穩定性,并且可以接受物質對其的修飾,展現出SF水凝膠廣泛的可行性。Yan L P等[57]報道了一種酶交聯SF水凝膠體系,用SF水凝膠包裹小鼠胚胎腫瘤細胞,并且進一步將海拉細胞摻入SF水凝膠中,通過體內雞絨毛膜尿囊膜腫瘤形成模型對構建的結構進行研究。實驗證明,在體內SF水凝膠可以抑制血管生成和腫瘤形成,并且蛋白質二級結構的轉變對其抑制腫瘤生長也有重要意義。WU C Y等[58]構建了一種雜化酶基SF水凝膠系統,用SF水凝膠負載葡萄糖氧化酶,使葡萄糖氧化酶逐漸從SF水凝膠釋放到腫瘤微環境中以介導葡萄糖的消耗,導致葡萄糖饑餓誘導的癌細胞死亡,為抗腫瘤循環系統中的重要組成部分,這些水凝膠為癌癥研究和生物材料的應用提供了新的見解。

4 現狀與展望

SF水凝膠無毒,可在體內降解,在一定范圍內水凝膠的儲能模數高于損耗模數,證明水凝膠有良好的熱穩定性,目前越來越多的實驗將其作為藥物緩釋載體。因方法、條件、誘導試劑不同對SF水凝膠復合物成凝膠時間長短不同,形成的復合水凝膠的性能也不同,對于各種誘導成凝膠的方法和試劑的選擇上還有待進一步研究(表1)。目前研究發現,在SF成凝膠過程中,其蛋白質二級結構無規卷曲變化到β-折疊,β-折疊的含量越高其支撐力學越強,且不同物質的修飾可以形成不同的藥物釋放特性(如pH值響應釋放、多重藥物釋放等)。當下的研究表明,SF水凝膠是一種良好的藥物緩釋載體,在局部給藥方面非常有前景。SF水凝膠具有可塑性、抗炎、傷口愈合等作用,因為桑蠶來源的SF沒有細胞黏附基序,導致SF水凝膠上培養的細胞顯示出低附著和遞增值,但其有良好的細胞相容,適合于填補空隙和清除腫瘤切除后殘留的腫瘤細胞。部分研究證實,裝載相應腫瘤敏感化療藥的水凝膠不僅可以發揮局部小范圍化療防復發的作用,還能激活免疫系統,達到全身抗腫瘤轉移的效果,這是未來對于腫瘤術后輔助治療的研究方向;隨著再生醫學的迅速發展,對受控給藥和細胞給藥的研究深入,合適的藥物緩釋載體是增加局部藥物濃度、減少副作用、降低耐藥的捷徑,SF復合水凝膠雖然可以通過添加物質改善SF水凝膠的孔徑、疏水性、機械性能等,但如何控制負載藥物前期的突釋仍然是人們探索的一個方向;目前研究還停留在動物腫瘤模型上驗證抗腫瘤的效果,且原位模型較少、給藥操作相對簡單,忽略了局部腫瘤微環境對復合水凝膠的影響,以及模型的穩定性、三維體外腫瘤模型較實體腫瘤細胞外基質的離子交換、pH值等因素,細胞外微環境的相似程度還有待進一步研究,未來的研究發展中還需進一步模擬腫瘤全面的周圍內環境和對此類凝膠制劑在體內的藥動學進行其機理的探索。

5 結 語

SF是良好的可再生的天然材料,具有多種獨特的優點,不同物質與SF水凝膠交聯后對SF水凝膠性質的影響不同,表明其可表現制備成多種不同的材料形式,其中SF水凝膠的載藥與緩釋能力是研究熱點,SF水凝膠結合化療藥物在腫瘤局部治療及其本身術后抗炎領域具有廣闊的應用前景。

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