臨床胰島制備研究進展

劉堯娟，鄒家琦

（1.天津市第一中心醫院移植中心，天津 300192；2.國家衛建委危重病急救醫學重點實驗室，天津 300100）

胰島移植（islet transplant）是一種β 細胞替代療法，主要用于治療反復發作低血糖的1 型糖尿病，可以安全、有效的維持患者血糖平衡，防治糖尿病相關的嚴重并發癥的發生和發展，是一種能夠恢復生理血糖控制且微創的治療方法。血糖控制是糖尿病相關慢性并發癥的關鍵因素。成功的胰島移植是使受者實現糖代謝正常，脫離外源性胰島素，使糖化血紅蛋白水平（haemoglobin A1c，HbA1c）恢復正常，減輕糖尿病誘導的器官衰竭以及降低因使用外源性胰島素導致嚴重低血糖事件危及生命的風險，進而改善受者生活質量。近年來，國內外胰島移植治療糖尿病取得長足進步[1，2]，其中埃德蒙頓方案將來自多個捐獻者的高質量胰島與無糖皮質激素的免疫抑制劑治療相結合，取得了較好的臨床療效，成為臨床胰島移植里程碑[3]。據報道[4]，40%～50%的患者在胰島移植后5 年仍然無需注射胰島素。人類胰腺中胰島數目在30 萬～150 萬。在目前的臨床制備技術下，一個胰腺內只有30%～50%的胰島被分離出來，因此提高胰腺分離是非常有必要的。盡管胰島移植在臨床結果方面取得了進展，但獲得足夠量移植胰島、提高移植療效仍然是一個具有挑戰性的過程。其中，胰島制備是提高臨床胰島移植長期療效的關鍵。本文從供體篩選、胰島分離過程、移植前培養等方面闡述影響胰島制備的因素，以期為臨床提高胰島分離產量提供參考。

1 供體體征對胰島產量的影響

在胰島移植過程中，大約30%的治療費用與胰島制備有關[5]，表明有效利用胰島資源至關重要。胰島移植發展的20 多年來，優化供體選擇以增加胰島的產量和質量，以更少的供體胰腺獲得更多的胰島一直是臨床的難點及重點。國內外許多研究均探討過供體因素與胰島產量之間的相關性[6，7]，其中體重、身高和身體質量指數（body mass index，BMI）是與胰島產量和質量相關性較高的供體特征[8-11]。Pilla SJ等[10]對芝加哥伊利諾伊大學芝加哥分校單中心的276 例胰島分離研究中發現，供體BMI 與胰腺大小、實際胰島數（actual islet count，AIC）、胰島當量（islet equivalent，IEQ）呈正相關，而冷缺血時間（cold ischemia time，CIT）與AIC、IEq/g 呈負相關，但BMI和CIT 與胰島大小分布沒有相關性。另有研究發現[6]，供體年齡并不影響胰島產量，但＜45 歲或更年輕供體患者的胰島移植功能參數均顯著升高。Briones RM等[12]研究報道，男性供者分離獲得足夠胰島供移植的概率明顯更高。此外，Denise E 等[13]研究報道，腦死亡供者與心臟死亡供者相比，腦死亡供者的胰島產量較低，提示供者死亡原因對胰島制備的結果同樣具有一定的影響。

基于不同因素對獲取胰島的影響，2005 年Gorman等首次提出了胰島供體評分（Islet Donor Score，IDS）系統，并成功地將其用于胰島制備的最佳胰島/供體選擇中[8，14]。該評分系統涉及詳細的捐獻者資料，包括年齡、體重、身高、BMI、體表面積、胰腺重量、死亡原因（大腦或心臟)、住院時間、是否使用升壓藥、血糖控制和冷缺血時間等[15]?；诙嘧兞糠治?，該方法確定了最重要的供體因子，并進行了相應的加權。IDS 系統的使用有助于以更客觀的方式評估復雜的供體信息，是標準化胰島供體分離的第一個重要部分。IDS 作為評分系統在埃德蒙頓開發，并在其他中心進行驗證[8]，目前已成為許多中心選擇供體和預測胰島分離結果的重要工具。2016 年，北美11 家研究中心通過分析1056 例胰島制備的供體特征，進行胰島供體評分，獲得了成功胰島分離的預測變量，并建立了北美胰島評分系統（North American Islet Donor Score，NAIDS）[15，16]。NAIDS 評分系統提示通過預估供體評分，可以提高胰島制備成功率，該評分系統作為一種有用的供體胰腺評估工具，可以優化供體選擇。因此，在移植術前對供體進行詳細評估，并制定相應的方案，可以提高獲取胰島的質量和數量。

2 胰島分離過程對胰島產量的影響

優化胰島分離過程是提高胰島產量和質量的有效方法。成功的人胰島分離對臨床及基礎研究應用至關重要，其在很大程度上受胰腺消化酶選擇的影響，因此不斷開發和使用高質量的酶是胰島分離的關鍵因素。由于每個供體胰島的細胞外基質和基底膜成分存在個體差異性，以致于胰島分離的組織解離酶（即膠原酶和蛋白酶）的功效受影響，這也是胰島分離難以實現標準化的原因之一。近年來膠原酶的改進經過了精煉和純化的過程，內毒素污染的減少和批次間差異的縮小是膠原酶改進的重要進步之一[17]。然而，單獨使用純化的膠原酶而不補充酶混合物，會導致胰腺消化不足。這些額外加入的蛋白酶對胰島從胰腺實質中適當釋放尤為重要，其可與膠原酶協同產生有效的胰腺消化，顯著提高胰島產量和質量。中性蛋白酶（neutral protease，NP）可進一步增強細胞外基質中所有主要成分的降解，在酶降解中起著重要的作用，且其與熱溶菌素（heat resistant lysol，TL）已廣泛應用于臨床胰島分離。此外，來自多黏菌Paneibacillus polymyxa 的BP 蛋白酶（BPP）及來自C.histolyticum 的梭狀芽孢桿菌的clostripain也已成功用于人類胰島的分離。另有研究表明[18]，溶解液中鈣離子的加入可促進胰腺消化，使胰島從胰腺腺泡組織中分離和釋放出來。但需要注意的是，消化過程中需要避免過度接觸蛋白酶，防止胰島分解破碎，降低胰島產量[19，20]。將胰島從胰腺腺泡組織釋放出來取決于對膠原酶和NP 的最佳濃度的利用，然而批次間的差異、制造方法的差異以及缺乏共同的酶活性分析方法導致無法準確評估不同種類酶的療效。

盡管許多改進胰島細胞分離消化階段的方法可以提高胰島回收率，但它仍然很難預測胰島純化后的結果。在大多數情況下，胰島在純化過程中丟失，導致獲得純化胰島量下降，因此優化胰島純化過程同樣至關重要。胰島純化最常用的方法是使用COBE 2991 細胞處理器的密度梯度離心法，該方法可以從胰腺外分泌組織中分離出不同純度的胰島[21]。聚蔗糖（Ficoll）溶液是胰島純化最常用的溶液，約1.077 g/ml Ficoll 通常用于低密度溶液，約1.100 g/ml Ficoll 用于高密度溶液。密度梯度離心在胰島純化回收方面的各種改進源于梯度介質、純化過程中的冷卻系統、純化前胰腺消化液的保存的發展。Noguchi H 等[22]通過改變碘二醇與純化液的體積比，控制密度梯度純化后胰島產量和純化后回收率均顯著高于標準連續梯度法。Robertson GS 等[23]研究表明，UW 溶液可以有效降低外分泌組織水腫，提高胰島純化率。與此同時，Masayuki S 等[24]設計的大瓶離心法，其在不使用COBE 2991 細胞處理器的情況下，用2 個500 ml 塑料容器制造密度梯度離心體系，純化所得高純度胰島較傳統COBE 組產量高。另外，由于供體胰腺個體差異，并非所有胰島均能被純化獲取，當純化袋中仍能發現大量未純化的胰島時，Zorzi D 等[25]通過重新收集、離心、洗滌、Ficoll 重懸等再次純化的方法對低純度胰島進行“補救”，可提高總胰島產量和胰腺利用率，且胰島功能評估結果與COBE 法純化所得胰島無明顯差異。此外，密度梯度離心法在胰島純化回收方面的各種改進還包括純化過程中的冷卻系統、純化前胰腺消化液的保存等，然而這些改進還沒有實現普遍一致性，因而尚未推廣應用。Mettler E 等[26]使用磁性分離胰島，該方法雖然可以分離豬胰島，且具有臨床應用潛力，但該項技術如何轉化到臨床應用至今尚未明確。

3 胰島培養對胰島移植結果的影響

對于新鮮分離胰島和培養后胰島的效果尚存在爭論。有研究表明[27]，新鮮分離的胰島比培養至少24 h 的胰島更好，其較培養第1、2、3 天的胰島數分別下降13%、24%、35%。Noguchi H 等[28]研究表明，在移植到糖尿病裸鼠中，與培養胰島相比，新鮮胰島的降糖能力明顯提高。由于培養過程或培養中的外分泌組織污染，使培養胰島可引起炎癥介質的過度表達[29]。此外，在培養過程中，胰島只能通過擴散獲得氧氣，大胰島核心更容易缺氧，進而引起氧化應激和凋亡誘導的基因上調[30]。研究表明[31，32]，培養后胰島直徑比新鮮胰島直徑要小，這表明培養過程中胰島產量降低的主要原因是胰島直徑的減小。因此，在培養過程中，瀕死的腺泡細胞釋放的有害酶可能對胰島細胞的生存有害。也有研究認為[33]，延長培養時間可以讓胰島從分離過程的壓力中恢復過來，但仍需進一步研究驗證。同時，胰島培養可以為臨床胰島移植提供諸多好處，包括胰島進行后續質量控制檢測、等待距離較遠患者到移植中心接受治療、確定患者并進行免疫誘導等。目前，國際胰島移植聯盟（CIT）仍將移植前培養作為臨床移植的標準程序。

研究表明[34]，在培養的24 h 內15%～20%的胰島消失。較長的冷缺血時間、較低的胰島純度、大胰島比例高均增加了胰島丟失的風險。既往有研究[35，36]比較了22 ℃～26 ℃和37 ℃環境培養效果，結果發現與37 ℃培養相比，22 ℃～26 ℃培養可以增加豬的胰島存活和DNA 復蘇，且在22 ℃～26 ℃的培養環境中可以預防胰島中央壞死。以上研究表明，22 ℃～26 ℃培養的胰島可能優于37 ℃培養。

培養過程中胰島質量和數量減少的機制之一是細胞凋亡[37]。研究表明[38]，經過消化和純化后的胰島缺乏周圍基底膜，這種缺失導致固縮核和凋亡小體的增加，并伴隨著促凋亡的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亞型p38和c-Jun 氨基端激酶（c-jin N-terminal kinase，JNK）活性升高。此外，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）等細胞因子的刺激也可導致胰島分離后的JNK 和p38 活性升高[39]。有報道稱[40]，抑制p38 的激活可以降低這些促凋亡活性。以上研究提示，在胰島培養的過程中，應用抑制JNK 和p38激活的抗凋亡藥物可有效防止胰島質量和數量的下降。

4 總結

胰島移植具有移植手術簡單、創傷小、治療效果好等優勢，已成為一種治療1 型糖尿病的有效方法。胰島移植成功與否取決于輸注胰島的質量和數量。盡管到目前為止人類胰島分離和純化方法已經較之前有重大進展，但由于供體胰腺本身存在個體差異，從單個胰腺中獲取足夠移植數量的胰島仍然困難。目前的研究仍需致力于通過細化供體篩選、優化胰島制備過程及移植前培養方面的提高獲取更高質量和數量的胰島，使其在受體內長期維持調控血糖的功能，從而保證胰島移植長期療效，為廣大糖尿病患者帶來福音，對推動糖尿病研究進展具有十分重要的意義。