外源性電刺激誘導干細胞心肌向分化的研究進展

戴越 周帆 穆軍升

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院心臟外科 北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029；2.解放軍總醫院第三醫學中心超聲科，北京 100039)

心血管疾病由于其高發病率而成為危害全世界人類健康的主要問題[1]。如果發生心肌梗死(myocardial infarction，MI)，存活的心肌細胞(cardiomyocytes，CM)數量會下降。隨著MI后纖維瘢痕組織的形成和心室組織的重塑，這不僅不利于心臟泵血，反而會造成剩余的心肌肥厚，梗死區心肌變薄，心室擴張。最終，導致心力衰竭發作。目前，臨床上沒有一種治療方式可逆轉MI造成的心肌損傷，因此臨床迫切需求新的治療方式來提高CM活性以改善心臟功能。通過將干細胞來源CM移植到MI區來修復受損的心肌和恢復心臟功能，被認為是治療MI最有前途的方式之一[2-3]。

然而，干細胞來源CM的特點是分化率低和不成熟狀態，其被移植到受損心臟后存在心律失常的風險，無法執行正常CM的功能[4-5]。在心臟收縮過程中，起搏器細胞從竇房結發出節律性電信號，通過細胞縫隙連接傳播至CM，再通過高導電性的浦肯野纖維傳導至心臟其他區域，最終實現整個心臟的節律性收縮。在此過程中，電信號和縫隙連接對心臟的同步搏動至關重要[6]。近些年，電刺激(electrical stimulation，ES)因其為非藥物治療手段以及在疾病治療方面的安全、方便、經濟等特點而受到廣泛關注。因此，外源性ES模仿心臟原始環境來誘導干細胞心肌向分化，成為了一種很有前途的方法[7-8]，這將進一步推動干細胞在MI治療的臨床應用進程。

1 外源性ES影響干細胞誘導分化的因素

CM之間通過閏盤結構形成縫隙連接，有利于細胞間的電興奮傳導并根據電信號在節律上同步收縮[9]。為了促進干細胞心肌向分化，在應用ES來模擬心臟電生理信號的過程中，優化所施加電場刺激的參數至關重要[10]。

1.1 脈沖方向

根據電流方向是否改變可分為單相脈沖和雙相脈沖。雖然單相脈沖能有效地刺激CM產生動作電位，但也會產生活性氧等物質造成組織損傷。雙相脈沖可有效防止組織損傷，但相應的其產生的中次級脈沖超極化可能會抑制動作電位的啟動[11]。

Baumgartner等[12]對胎鼠CM連續6 d施加振幅1 V、脈寬5 ms和頻率10 Hz的單相脈沖，ES促進了細胞形態伸長和平行排列以及縫隙連接蛋白(connexin，Cx)43的表達。Pietronave等[13]對人類祖細胞分別施加電場強度2.5 V/cm、頻率1 Hz和脈寬1 ms的雙相方波脈沖以及具有相同總幅度和持續時間的單相方波脈沖(5 V/cm、1 Hz和2 ms)。他們發現雙相脈沖刺激組更早表達Cx43，早期心臟轉錄因子表達上調，如肌細胞增強因子2D、鋅指轉錄因子蛋白4和Nk2型同源盒轉錄因子5，以及晚期心臟肌節蛋白表達增加，如心肌肌鈣蛋白T、心臟α-肌動蛋白和肌漿內質網Ca2+ATP酶。說明雙相脈沖更快、更有效地促進了人類祖細胞的心肌向分化。綜上，單相脈沖刺激可更有效產生動作電位，引起更少的電極腐蝕，但會在長期刺激中增加組織損傷；而雙相脈沖刺激可長期產生有效刺激并不會引起組織損傷，雖然與單相脈沖相比不易產生有效動作電位和更易產生電極腐蝕，但雙向脈沖刺激可通過改變ES條件，如雙向電荷平衡和雙向電荷不平衡等來減少相應的副作用[11]。因此雙相脈沖ES具有更優的選擇性，可能對長期干細胞心肌向分化過程更有利。

1.2 電場強度與持續時間

對于相同的電場強度，當脈沖持續時間較長時，細胞凋亡率更高[14]。因此在體外對細胞施加ES時，協調其電場強度和持續時間十分重要。

為了探究ES持續時間對人心球源性細胞(human cardiosphere-derived cells，hCDCs)心肌向分化的影響，Nazari等[15]向hCDCs施加強度為150 mV、頻率1 Hz和電流2 mA的電荷平衡雙相脈沖，并分別持續1、3和5 d，每天ES 5和10 min。結果發現持續5 d，每天ES 10 min組的心肌肌鈣蛋白T和鋅指轉錄因子蛋白4表達最高，但α-肌球蛋白重鏈表達下降。Ma等[16]應用1 V/cm、5 Hz的參數對人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)施加持續30 d的ES后，發現心源性基因表達上調，并將誘導分化的心肌樣細胞(hiPSC-derived CMs，hiPSC-CMs)注射到小鼠梗死心臟區后，發現心臟功能的改善和梗死面積的減少。

1.3 ES起始作用時間

ES的影響部分程度上取決于第一次ES時細胞的分化程度。如果施加時間太早，ES會抑制心肌蛋白的聚集并產生不良的收縮行為。如果施加時間太晚，ES不再有助于細胞的功能組裝。

Radisic等[17]分別對1、3和5 d齡的新生大鼠心室肌細胞施加ES。1 d齡的心室肌細胞受到ES后，Cx43和α-肌球蛋白重鏈含量均下降，產生低度分化的單層CM，無法產生同步收縮。而5 d齡的心室肌細胞受到ES后只建立縫隙鏈接，無有效的收縮功能。最終發現3 d齡的新生大鼠心室肌細胞ES處理后具有更優的收縮能力和縫隙鏈接。Ronaldson-Bouchard等[18]對體外培養的hiPSC-CMs早期(第一次自發收縮后，第12天)和晚期(第28天)施加ES，結果發現早期hiPSC-CMs顯示出明顯的可塑性，說明hiPSCs對ES反應性隨分化進程的進行而下降。Chen等[19]分別對4、7和12 d齡的擬胚體施加ES，這分別對應于干細胞分化的早期、中期和末期3個階段，ES參數為電流強度10、30和60 μA、頻率1 Hz、脈寬10 ms的雙相ES培養4 d。低強度ES對早期分化階段的干細胞作用不大，但在60 μA的ES下，其β-肌球蛋白重鏈水平顯著增加。對于中期分化階段的干細胞而言，β-肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白T在30 μA刺激時表達增加，而在60 μA時表達降低。在末期分化階段，肌鈣蛋白T表達水平隨ES幅度增加而增加。這說明不同分化階段的胚胎干細胞對ES有不同程度的敏感性，因此根據ES起始作用時間來調整其參數是十分重要的。

1.4 頻率

ES頻率可影響CM的收縮和搏動行為。頻率為1～2 Hz的ES可誘導細胞內Ca2+水平瞬時激增，同時促進肌節組裝和成熟[7]。有證據[8]表明，自主搏動hiPSC-CMs的搏動頻率隨著ES頻率變化而變化，即使在ES停止后，hiPSC-CMs獲得的搏動頻率也可保持在所施加的ES頻率水平并持續傳導到周圍細胞中。因此，在分化或成熟過程中，由于hiPSC-CMs具有電生理可塑性，易導致生成具有與移植目標心肌區域不同搏動頻率的心肌樣細胞，這將有引起心律失常的風險，而搏動頻率是由ES誘導決定的，因此應優化ES頻率。

Tandon等[20]對新生大鼠CM的組織工程心臟構建體施加3 V/cm，脈寬2 ms，頻率分別為1、3和5 Hz的單相方波脈沖。研究表明3 Hz組有最高濃度的心肌肌鈣蛋白和Cx43以及最好的收縮行為。Zhang等[21]對預培養2 d后的hiPSC-CMs施加ES。首先以1 Hz的頻率連續刺激5 d，然后每天以1 Hz的頻率遞增刺激，直到頻率達到6 Hz并保持6 Hz頻率2 d，最后再以1 Hz頻率刺激14 d。觀察到hiPSC-CMs的Cx43表達增高，形成了更成熟表型的功能性心臟組織。Hirt等[22]設計了兩種ES方案：頻率恒定0.5 Hz和第1周2 Hz隨后1.5 Hz，電場強度2 V/cm，脈寬4 ms的雙相脈沖，分別作用于hiPSC-CMs，第2種方案衍生的CM具有更強的自發搏動和更高的細胞質與細胞核比。Ronaldson-Bouchard等[18]也對hiPSCs施加了兩種方案的ES，4.5 V、2 ms單相方波脈沖：(1)2 Hz刺激3周；(2)2周內頻率從2 Hz到6 Hz(每天增加0.33 Hz)，然后2 Hz培養1周。結果是第2種方案刺激效果更好，進一步驗證了增加誘導收縮的ES頻率可促進被誘導分化細胞的超微結構形成和功能發育。Nunes等[23]對hiPSC-CMs施加7 d的ES，電場強度為5 V/cm，脈寬1 ms，頻率從1 Hz開始逐步增加到3 Hz或6 Hz。他們發現與1～3 Hz的低頻增加方式相比，1周內1～6 Hz的起搏頻率可進一步增強工程心肌組織的結構和電生理功能。而Zhao等[24]對胚胎干細胞和誘導多能干細胞來源的CM組織施加兩種ES方案，方案一是頻率從2 Hz到6 Hz，每周增加1 Hz，方案二是頻率從1 Hz到6 Hz，每天增加0.2 Hz，其余條件保持一致。結果發現兩種方案都可促進心臟組織功能發育，并且心肌肌鈣蛋白T和Cx43等心肌蛋白表達沒有區別，但方案一具有更高的收縮間歇后力增強效應、最大捕獲速率等結果，這說明方案一刺激下組織成熟度更高。因此合理的頻率遞增將更有助于干細胞心肌向分化并促進組織成熟度。

2 ES誘導干細胞心肌向分化的相關機制

雖然研究表明ES可在心臟發育成熟的過程中起到關鍵作用，但其中涉及的機制尚不完全清楚。

2.1 過去研究

伍長學等[25]發現隨ES時間推進，肌細胞增強因子2C基因的表達上調，進而促進肌鈣蛋白I的表達和CM的形成。Genovese等[26]發現ES后人骨髓間充質干細胞中卵泡抑素的表達上調，證明短期ES促進了人骨髓間充質干細胞的心肌向分化。近年來，卵泡抑素已被證明是肌肉發育、分化和再生的關鍵。它可通過參與中胚層和內胚層組織的修復來促進細胞增殖并限制纖維化[27]。

2.2 最新進展

He等[28]發現在ES的作用下，骨髓間充質干細胞發生心肌向分化原因之一是轉化生長因子β1表達上調，促進了Cx43和肌動蛋白α2的表達，并且這一過程受轉化生長因子β1抑制劑吡非尼酮的影響。

Nazari等[15]對hCDCs施加ES，發現hCDCs的分化高度依賴于電流的同步傳輸。這是通過由最佳排列和伸長的CM構成的名為“合胞體”的結構實現的。當施加恒定幅度的脈動電流，受到刺激hCDCs橫向堆積，即與電流方向垂直。對齊的CM開始像電容器一樣發揮作用，響應于施加的ES而充電和放電。CM的這種搏動特性促進了同步肌纖維收縮的形成。

Crestani等[29]發現暴露于ES的hiPSC-CMs中的閏盤蛋白伴肌動蛋白相關錨定蛋白和β-連環蛋白的表達增加。Wnt/β-連環蛋白信號傳導通路已被證實在hiPSCs心肌向分化和縫隙連接形成中起著重要作用[30]。伴肌動蛋白相關錨定蛋白表達參與發育過程中的肌原纖維肌生成和成熟肌肉中的細胞-細胞連接[31]。表明ES可能通過激活Wnt/β-連環蛋白通路促進hiPSC-CMs成熟度的提高。

Ma等[16]發現ES促進hiPSCs心肌分化，可能機制為激活Ca2+/蛋白激酶C/細胞外信號調節激酶通路。蛋白質印跡表明，ES增強了Ca2+結合蛋白(鈣調蛋白1和3)和蛋白激酶C表達以及細胞外信號調節激酶磷酸化，抑制了組蛋白去乙酰化酶1的表達，以上兩種效果均可被鈣信號抑制劑消除甚至逆轉。鈣信號抑制劑包括維拉帕米(鈣通道阻滯劑)、W-7(鈣調蛋白拮抗劑)和8-(N，N-二乙胺)-n-辛基-3，4，5-三甲氧基苯甲酸酯(細胞內鈣離子拮抗劑)。有研究表明，當骨髓間充質干細胞中組蛋白去乙酰化酶1基因表達受到特異性抑制時，與心肌發育和結構相關的基因的mRNA表達水平升高[32]。因此，ES可能通過激活細胞內Ca2+信號和下游基因來增強hiPSCs的心臟基因表達。

Haneef等[33]發現將ES作用于3D膠原支架上的干細胞可促進其心臟標志物的表達，并發現3D膠原支架具有類似于天然的細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)功能，如提供結構強度和抗變形能力。ECM主要由為左心室提供結構強度的膠原蛋白組成。最新研究[27]表明，這可能與糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)的導電性和膠原蛋白的壓電性有關。GAG在ECM中廣泛分布，富含可電離的羧基和硫酸根，具有電荷轉移特性。在施加ES期間，GAG充當ECM到細胞的電導管。同時，ES會增加蛋白多糖的合成，每一種蛋白多糖都含有特定的GAG側鏈，特定的GAG側鏈對組織功能和發育具有重要意義。與此同時，膠原蛋白具有固有壓電特性，當組織被壓縮時會產生電荷，對嵌入其中的細胞產生調節作用。膠原組織是由高度排列的纖維狀Ⅰ型和Ⅱ型膠原堆積和交聯結構組成的，主要存在于骨、軟骨組織[34]和心肌[35]。

3 ES作用于干細胞來治療MI的問題與展望

不同條件下，不同的ES參數可能對應著不同干細胞的不同分化方向，如心房、心室、傳導細胞等。Chan等[36]認為電場強度6.6 V/cm、脈寬2 ms和頻率1 Hz的雙相脈沖刺激是人胚胎干細胞源CM最佳ES參數。Hernández等[37]發現ES誘導干細胞心肌向分化受細胞系影響。Crestani等[29]發現當ES參數為10 V、4 ms、1 Hz和2 h/d時，人類多能干細胞向更成熟的心室傳導樣細胞分化，心室傳導系統相關基因表達增高，Cx40表達增高，Cx43表達(由縫隙連接蛋白α1編碼)下降。易洛魁族同源盒3基因在精確調節細胞間縫隙連接耦合和心臟脈沖傳播中起到關鍵作用，可直接抑制Cx43轉錄并間接激活Cx40轉錄[38]。

未來工作的領域包括摸索出完善的ES條件對應不同干細胞的模型標準，為后續進一步完善ES誘導分化機制的研究，將組織工程與相關干細胞心肌向分化ES方案結合，這在MI治療的臨床應用研究方面具有廣闊前景。

4 結論

綜上所述，ES是解決干細胞來源CM分化率低和不成熟的有效方法之一。在臨床實踐中，應根據不同的干細胞量身定制ES方案，以產生最佳的促進效果。此外，如果在ES的同時施加其他相關刺激，可能會產生協同或拮抗作用，如機械刺激、基質等。