老年小鼠慢性痛焦慮模型腸道菌群的變化規(guī)律

趙艷 蔡國(guó)洪 任牡丹 趙倩 羅妙莎 馬文慧 和水祥

焦慮癥主要以焦慮情緒體驗(yàn)為特征[1]，主要表現(xiàn)包括無(wú)明確客觀對(duì)象的緊張擔(dān)心、坐立不安以及植物神經(jīng)功能失調(diào)等癥狀[2]。老年人更加容易患有焦慮癥，且缺少有效和及時(shí)的治療。患有心腦血管疾病、惡性腫瘤和慢性疼痛等疾病的老年人易出現(xiàn)心理障礙問(wèn)題。因此，對(duì)老年人焦慮癥的發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究顯得尤為重要。

腸道菌群是胃腸道中抵抗病原體和有害因素的重要系統(tǒng)[3-4]。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與焦慮癥、抑郁癥等精神疾病密切相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，老年動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出焦慮樣行為，但是具體的機(jī)制尚不清楚。選擇性坐骨神經(jīng)損傷(SNI)模型是常用的神經(jīng)病理性痛伴焦慮的模型[7]。本文旨在通過(guò)研究老年鼠慢性痛伴焦慮模型的腸道菌群變化，探討老年焦慮癥的病理機(jī)制，為進(jìn)一步改善老年焦慮癥的治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)采用雄性C57BL/6老年小鼠(16月齡)，為第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的二級(jí)清潔動(dòng)物。隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)符合國(guó)家醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理標(biāo)準(zhǔn)，室內(nèi)溫度保持在22 ℃～24 ℃，濕度約50%，飼養(yǎng)環(huán)境整潔衛(wèi)生，及時(shí)補(bǔ)充水和食物。動(dòng)物房保持12 h/12 h的晝夜調(diào)控，行為學(xué)檢測(cè)在12:00～18:00之間進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC 20200161)。

1.2 方法

1.2.1 SNI模型建立：腹腔注射濃度為2%戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，充分暴露坐骨神經(jīng)的三支分支。結(jié)扎坐骨神經(jīng)的腓總神經(jīng)和脛總神經(jīng)分支，并在遠(yuǎn)端剪斷。對(duì)照(control, CON)鼠僅暴露坐骨神經(jīng)，不進(jìn)行神經(jīng)結(jié)扎和剪斷操作，術(shù)后縫合并消毒切口。

1.2.2 小鼠神經(jīng)病理性痛模型機(jī)械痛敏檢測(cè)[8]：在SNI小鼠建模后的第21天用Von-Frey 纖維絲檢測(cè)模型組和對(duì)照組小鼠手術(shù)側(cè)(左側(cè))下肢的機(jī)械痛閾值。用 Von-Frey纖維絲刺激小鼠的足底，刺激強(qiáng)度為0.04～2.4 g；Von-Frey纖維絲刺激后，小鼠的縮足或者舔足動(dòng)作視為陽(yáng)性反應(yīng)。每種刺激強(qiáng)度各進(jìn)行5次，如有3次出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則該刺激強(qiáng)度為該小鼠的機(jī)械痛閾值。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test, OFT)[9]：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻采集的時(shí)長(zhǎng)為6 min，用Smart 3.0 軟件分析小鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)軌跡。曠場(chǎng)劃分為4×4方格，將中央的4個(gè)方格定義為中央?yún)^(qū)域，將四周的12個(gè)方格定義為周?chē)鷧^(qū)域；最后用Smart 3.0軟件統(tǒng)計(jì)小鼠在曠場(chǎng)活動(dòng)的總路程和在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的時(shí)間。

1.2.4 高架十字實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze，EPM)：EPM在OFT之后進(jìn)行，間隔至少1 h。視頻采集的時(shí)間為6 min，用Smart 3.0軟件統(tǒng)計(jì)小鼠在EPM活動(dòng)的總路程和在開(kāi)臂區(qū)活動(dòng)的時(shí)間。

1.2.5 小鼠糞便采集(自然排便法)[10]：將待取便的小鼠放置于無(wú)菌的小鼠籠子里自然排便，然后用無(wú)菌鑷子收集糞便，裝入1.5 mL無(wú)菌EP管并小心地閉合管蓋。將裝有糞便的EP管立即放至于-80 ℃冰箱保存，待后續(xù)檢測(cè)。

1.2.6 16S rDNA測(cè)序：接收DNA樣品以后，對(duì)樣品的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。構(gòu)建文庫(kù)：回收目的擴(kuò)增子片段，用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端，再將堿基“A”加到3′端，讓DNA片段能與帶“T”堿基的接頭連接。磁珠篩選目的Amplicon片段，用合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備和測(cè)序。

除以上三種類型的指標(biāo)之外，還有一種“紅線”型指標(biāo)，通常給出目標(biāo)的最低值或最高值，要求在一定時(shí)間段內(nèi)不能越過(guò)邊界，常見(jiàn)于環(huán)保類指標(biāo)，如耕地紅線等。若當(dāng)年的實(shí)際完成值未超過(guò)目標(biāo)界限，則視當(dāng)年的年度完成率為20%，否則記為0。若五年內(nèi)每年都在目標(biāo)界限內(nèi)完成，即視為完成五年目標(biāo)的100%。

2 結(jié)果

2.1 2組機(jī)械痛閾值及體質(zhì)量比較 與對(duì)照組相比，模型組小鼠左側(cè)下肢機(jī)械縮足閾值顯著降低(P<0.001)，體質(zhì)量在21 d后也顯著下降(P=0.013)，見(jiàn)表1。提示老年小鼠SNI手術(shù)后長(zhǎng)期的慢性神經(jīng)病理性疼痛影響小鼠的正常生活，導(dǎo)致小鼠的體質(zhì)量降低。

表1 2組機(jī)械痛閾值及體質(zhì)量比較

2.2 SNI小鼠術(shù)后21 d焦慮樣行為檢測(cè) SNI術(shù)后第21天，小鼠進(jìn)入OFT中央?yún)^(qū)和EPM開(kāi)臂區(qū)的活動(dòng)時(shí)間較對(duì)照組明顯減少，提示SNI小鼠有焦慮樣行為(P<0.01)。模型組和對(duì)照組在OFT和EPM的活動(dòng)總路程沒(méi)有差異，提示其運(yùn)動(dòng)功能沒(méi)有受影響(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 2組焦慮樣行為檢測(cè)結(jié)果

2.3 腸道菌群檢測(cè) 將測(cè)序的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)進(jìn)行物種的分類。根據(jù)物種所占的比例數(shù)據(jù)，制作每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品在門(mén)、綱、目、科這幾個(gè)等級(jí)中不同物種分布的柱狀圖，并對(duì)含量最多的3個(gè)物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3.1 菌群分布的相似性分析：老年小鼠SNI建模手術(shù)21 d后OTU重疊的數(shù)量較對(duì)照組顯著降低，提示菌群分布的相似性降低。見(jiàn)圖1A，1B。

如果兩個(gè)樣品距離越近，則表示這兩個(gè)樣品的組成越相似。主成分分析(PCA)結(jié)果顯示，老年小鼠SNI建模手術(shù)21 d后與手術(shù)前距離很遠(yuǎn)，提示手術(shù)后21 d OTU組成發(fā)生了顯著的變化。而對(duì)照組距離很近，提示對(duì)照組小鼠OTU組成沒(méi)有發(fā)生變化。見(jiàn)圖1C，1D。

注：(A)對(duì)照組手術(shù)前后小鼠OTU的Venn圖；(B)模型組手術(shù)前后小鼠OTU的Venn圖；(C)對(duì)照組手術(shù)前后小鼠OTU的PCA；(D)模型組手術(shù)前后小鼠OTU的PCA

2.3.2 門(mén)分類水平：在門(mén)分類水平，對(duì)比豐度最高的3種細(xì)菌，結(jié)果顯示模型組與建模前相比，擬桿菌(P=0.599)、厚壁菌(P=0.489)沒(méi)有明顯變化，而2β-變形菌顯著減少(P=0.003)。見(jiàn)圖2。

注：**P<0.01

圖3 綱分類水平中豐度最高的3種細(xì)菌占比

2.3.4 目分類水平：在目分類水平，對(duì)比豐度最高的3種細(xì)菌，結(jié)果顯示模型組與建模前相比，擬桿菌和梭菌沒(méi)有明顯變化，乳桿菌顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

注：*P<0.05

2.3.5 科分類水平：在科分類水平，對(duì)比豐度最高的3種細(xì)菌，結(jié)果顯示SNI模型組與建模前相比，普雷沃氏菌顯著減少(P<0.01)，腸桿菌、未歸類菌沒(méi)有明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

注：**P<0.01

2.3.6 SNI老年小鼠腸道菌群Alpha多樣性分析：Alpha多樣性分析中的observed species指數(shù)、chao指數(shù)和ACE指數(shù)可反映樣品中物種的豐富度(species richness)，即指數(shù)越大，說(shuō)明樣品中的物種越豐富。結(jié)果顯示，手術(shù)21 d后，老年SNI模型鼠observed species指數(shù)、chao指數(shù)和ACE指數(shù)均較建模前顯著降低，提示SNI模型菌群多樣性降低。見(jiàn)圖6。

注：*P<0.05

3 討論

我國(guó)是老齡化社會(huì)，65歲及以上人口占人口總數(shù)的13.5%。關(guān)注老年人健康不僅是社會(huì)問(wèn)題，同時(shí)也是重要的醫(yī)學(xué)課題。老年人的焦慮癥常常容易被忽略，可能會(huì)導(dǎo)致或加劇認(rèn)知障礙或其他病癥的發(fā)病，因此需要更多的社會(huì)關(guān)注和科學(xué)研究。前期大量的研究也發(fā)現(xiàn)，老年動(dòng)物或者老年人會(huì)更容易出現(xiàn)焦慮行為，但是具體的分子機(jī)制還不清楚。老年焦慮癥病人與青年焦慮癥病人的發(fā)病機(jī)制是否不一樣？這些都是有待研究的科學(xué)問(wèn)題。本研究通過(guò)建立老年鼠慢性痛焦慮模型，分析對(duì)比腸道菌群的變化，探討腸道菌群在老年鼠慢性痛焦慮模型中的作用，為進(jìn)一步開(kāi)展微生物治療提供理論依據(jù)。

本研究所使用的是慢性痛焦慮模型小鼠，遭受慢性神經(jīng)病理痛的病人會(huì)經(jīng)歷焦慮癥或抑郁癥的折磨，既往研究已經(jīng)驗(yàn)證了此模型在感覺(jué)和情感情緒等維度的運(yùn)用[7, 11]。本研究利用OFT和EPM檢測(cè)出該模型老年小鼠具有焦慮樣行為。

既往大量的研究結(jié)果顯示,腸道菌群在抑郁癥的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[5]。但是，觀察神經(jīng)病理性疼痛模型的腸道菌群變化研究比較少。Yang等[12]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性痛伴隨興趣缺失模型小鼠的腸道菌群發(fā)生了顯著的變化。本研究中，腸道菌群分析結(jié)果表明，老年慢性痛焦慮模型鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，菌群多樣性降低。在門(mén)分類水平，老年SNI模型小鼠2β-變形菌顯著減少。在目分類水平，乳桿菌顯著減少；在科分類水平，普雷沃氏菌顯著減少。

既往研究認(rèn)為，焦慮等不良情緒通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)改變腸道通透性、破壞腸道黏膜屏障、激活免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致腸道菌群紊亂[13]。反過(guò)來(lái)，腸道菌群也能通過(guò)多種途徑在焦慮、抑郁等精神疾病中發(fā)揮著作用。近年來(lái)的“腸道菌群-腸-腦軸”(microbe-gut-brain axis, MGBA)學(xué)說(shuō)被廣泛認(rèn)可。腸道菌群可以產(chǎn)生多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)活性分子，也可以通過(guò)發(fā)酵碳水化合物來(lái)增強(qiáng)免疫反應(yīng)。目前已知的腸道菌群參與調(diào)控的神經(jīng)遞質(zhì)包括了多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺等[14]。這些都可能是腸道菌群參與焦慮情緒發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。

目前，已經(jīng)有研究著眼于通過(guò)腸道菌群的改變來(lái)治療焦慮癥。有研究發(fā)現(xiàn)，直接將腸道微生物移植到動(dòng)物體內(nèi)，就能導(dǎo)致目標(biāo)動(dòng)物發(fā)生行為學(xué)上的變化[15]。這也為進(jìn)一步使用益生菌或進(jìn)行糞菌移植提供了理論依據(jù)。Zheng等[16]將抑郁癥病人的糞便移植到了無(wú)菌小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生了相應(yīng)的菌群紊亂，并表現(xiàn)出抑郁樣的行為。而在小鼠焦慮模型中，經(jīng)過(guò)益生菌的治療，小鼠行為可恢復(fù)正常[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)雙歧桿菌治療的小鼠表現(xiàn)出較少的焦慮樣行為[18]。益生菌和抗生素調(diào)節(jié)腸道菌群這一新靶點(diǎn)，可能成為治療焦慮癥的一個(gè)新途徑。

綜上所述，本研究通過(guò)建立老年鼠慢性痛焦慮模型，發(fā)現(xiàn)老年慢性痛焦慮模型小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了紊亂，菌群多樣性降低。在不同分類水平，菌群分布均發(fā)生了顯著變化，這為開(kāi)發(fā)新的治療模式提供了理論依據(jù)。未來(lái)有待進(jìn)一步開(kāi)展高質(zhì)量的研究，以期為證實(shí)腸道菌群與老年焦慮癥病人的相關(guān)性及病因機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。