非酒精性脂肪性肝病體外模型的研究進展

盧曉臣， 韓紅梅

延邊大學附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 吉林 延吉 133000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是在無過量飲酒的情況下出現(xiàn)肝脂肪堆積，并且至少5%的肝細胞存在脂肪變性[1-2]，其疾病譜包括非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化以及肝細胞癌[3]。最近研究[4]發(fā)現(xiàn)，高達30%的NAFL患者可發(fā)展為NASH。而且成人中NAFLD的全球患病率約25%[5]，在一些國家已成為肝移植最常見的原因[6]。然而，目前仍無針對NAFLD的特異性藥物。在發(fā)病機制方面最受認可的是“多次打擊”學說[7]，NAFLD體外和體內(nèi)模型在相關研究中發(fā)揮重要作用。本文將NAFLD體外模型的研究進展總結如下，主要從細胞系和培養(yǎng)方式兩方面闡述。

1 不同細胞系在NAFLD體外模型中的應用

1.1 原代細胞

原代細胞是使用兩步膠原酶灌注或利用磁性細胞分離技術從切除的肝組織中分離出來的細胞。原代細胞在很短的時間內(nèi)可保持其來源的形態(tài)和功能特征，然而其生命和擴增能力有限，不適于研究長期培養(yǎng)。

1.1.1 人原代肝細胞(primary human hepatocyte, PHH) PHH是直接從人肝組織中分離獲得的，最接近體內(nèi)肝細胞表型[8]。Huang等[9]將PHH暴露于15 μg/mL棕櫚酸中48 h，建立NAFLD細胞模型后，用文蛤寡肽處理24 h，發(fā)現(xiàn)文蛤寡肽通過提高超氧化物歧化酶活性，發(fā)揮抗氧化應激作用，同時文蛤寡肽通過減少磷酸化氨基末端蛋白激酶和促凋亡蛋白基因Bax表達，降低半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3活性，發(fā)揮抗凋亡作用。正常肝組織在臨床實踐中很難獲得，需要倫理授權，并且其分離和培養(yǎng)比較復雜。雖然目前PHH已被產(chǎn)品化，易購買，然而PHH具有供體之間的遺傳變異以及表型不穩(wěn)定問題，可能引起偏差，導致研究缺乏可重復性[10-11]。因此，PHH似乎特別適用于不需要長時間培養(yǎng)的藥物代謝研究，在較小程度上適用于NAFLD的建模。

1.1.2 嚙齒動物原代肝細胞 嚙齒動物的原代肝細胞廣泛用于研究肝內(nèi)甘油三酯 (TG)代謝的過程，尤其是酯化過程及如何影響脂肪酸進入氧化途徑，以及可能影響肝內(nèi)TG通過極低密度脂蛋白輸出的因素。嚙齒動物的原代肝細胞與PHH相比更易獲得，但是僅能部分復制人類的NAFLD模型[12]。Ju等[13]對雄性C57BL/6小鼠的肝門靜脈內(nèi)灌注漢克斯氏平衡鹽溶液后分離出肝組織，然后用含膠原酶(Ⅰ和Ⅳ型)的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，離心獲得小鼠原代肝細胞。將獲得的小鼠原代肝細胞以及用富含半胱氨酸61 蛋白(cysteine-rich protein 61，Cyr61或CCN1)干預后的小鼠原代肝細胞，暴露于0.5 mmol/L的游離脂肪酸(free fat acid，F(xiàn)FA)(油酸∶棕櫚酸=2∶1)中培養(yǎng)24 h，成功誘導建立NAFLD細胞模型，發(fā)現(xiàn)CCN1增加了小鼠原代細胞內(nèi)TG水平，增加了TNFα、單核細胞趨化蛋白1、凋亡相關蛋白水平，同時也提高了半胱天冬酶-3和促凋亡蛋白基因Bax的表達水平，提示CCN1促進了NAFLD的進展。另有研究[14]利用24～32 d的雌性C57BL6J小鼠獲得原代肝細胞，然后將原代肝細胞加入含有棕櫚酸濃度梯度為0～0.1 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)0.02 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)的肝細胞具有最高的細胞活力和脂肪積累率，并發(fā)現(xiàn)補骨脂可通過抑制蛋白激酶C/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽氧化酶信號途徑減輕棕櫚酸誘導的小鼠原代肝細胞脂肪變性。

1.2 傳代細胞

在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞。傳代細胞顯示出比原代細胞更高的復制能力和穩(wěn)定的表型，具有高可用性、易于處理和無限的使用壽命的優(yōu)點，成為有吸引力的造模細胞，然而其在傳代過程中，一些細胞會發(fā)生形態(tài)學改變，導致難以培養(yǎng)，從而限制了其應用[15]。以下介紹幾個常用的傳代細胞。

1.2.1 HepG2細胞 HepG2細胞是來源于肝母細胞瘤的一種上皮細胞，并保留了肝實質(zhì)細胞的幾種生化功能，不僅易于處理，而且有無限的使用壽命。因此，HepG2細胞已成為有吸引力的模型細胞。制備NAFLD細胞模型時，通常用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，多采用油酸、油酸和棕櫚酸、脂肪乳劑以及引起脂質(zhì)堆積的培養(yǎng)液等誘導。這可導致細胞內(nèi)TG水平升高105%～1100%，在油紅O染色下可觀察到細胞內(nèi)大量脂滴積累、胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不一的橘紅色脂滴、細胞內(nèi)線粒體數(shù)量較少、內(nèi)嵴數(shù)量減少、脂滴形態(tài)學變化極為明顯[16]。因此，HepG2細胞曾一度作為在NAFLD細胞模型研究中最常用的細胞。然而，HepG2細胞畢竟來源于腫瘤細胞，與正常肝細胞相比，兩者的生理條件存在很大差異，而且腫瘤細胞代謝較快，導致藥物作用的時間太短，而無法觀察到藥效。因此，目前HepG2細胞主要用于NAFLD脂質(zhì)代謝研究。

1.2.2 HuH7細胞 HuH7細胞來源于高分化的肝細胞癌，具有無限的生長潛力，而且在整個培養(yǎng)時間內(nèi)均具有穩(wěn)定的表型。HuH7細胞和HepG2細胞具有相似的缺點，目前也是主要用于NAFLD脂質(zhì)代謝研究。

1.2.3 HepaRG細胞 源自人類肝細胞癌的HepaRG細胞具有一些肝祖細胞的特征和特性(可以轉(zhuǎn)分化為肝細胞和膽管細胞)。HepaRG細胞表達各種酶和受體(如組成性雄甾烷受體、孕烷X 受體、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等)，并且在功能蛋白表達上不遜于PHH，因此HepaRG細胞已被推薦用于藥物代謝和毒性研究[17]，是研究NAFLD藥物開發(fā)方面具有潛力和優(yōu)勢的細胞系。

1.2.4 LO2細胞 LO2細胞是永生化的人正常肝細胞，具有正常肝細胞的生物學特性和肝功能，通過誘導構建的高脂細胞模型，能建立一種接近于臨床的NAFL或NASH肝細胞模型，與HepG2細胞相比，LO2細胞更適于NAFLD細胞篩藥模型研究。LO2細胞通常用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，多采用油酸、胎牛血清、油酸和棕櫚酸、脂肪乳等，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導并成功建立細胞模型后，細胞內(nèi)TG水平升高32%～428%，油紅O染色觀察到細胞明顯增大，細胞內(nèi)有較多較大的紅色脂肪滴，甚至出現(xiàn)脂肪滴的融合現(xiàn)象，趨向于大泡性脂肪樣變，細胞內(nèi)脂滴形態(tài)學變化極為明顯[16]。近幾年LO2細胞常用于建立NAFLD細胞模型。

1.3 肝細胞樣細胞(hepatocyte-like cell，HLC) HLC是由人類干細胞分化而來的細胞，包括肝干細胞和胚胎多能干細胞[18]。人類干細胞在生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)的聯(lián)合培養(yǎng)下可在體外分化為HLC[19]。Deepak等[20]采用葡萄糖攝取法測定HLC的功能，并與PHH進行比較，結果發(fā)現(xiàn)在兩種細胞類型中，葡萄糖的攝取量大致相同，提示HLC的功能類似于PHH。進一步實驗采用油酸和棕櫚酸(75 μmol/L∶25 μmol/L)的脂質(zhì)混合物處理HLC 24 h，建立了體外NAFL模型，發(fā)現(xiàn)與NAFL進展相關的基因如水通道蛋白1、Ⅲ型膠原蛋白α1和Ⅰ型膠原蛋白α1基因表達增加，這些基因已被證實為NAFLD疾病進展的生物標志物[21]。另一項研究[22]將HLC加入含有乳酸鈉、丙酮酸鈉和辛酸(10 mmol/L∶1 mmol/L∶2 mmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)NASH線粒體功能障礙相關的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(如細胞死亡活化蛋白抗體、醛酮還原酶AKR1C2和醛酮還原酶AKR1C4)含量減少及其相關的代謝產(chǎn)物酰基肉堿和肉堿代謝產(chǎn)物失調(diào)，這些表現(xiàn)與NASH早期患者中觀察到的一致，該模型對研究已知遺傳背景的NAFLD發(fā)病機制具有重要意義。HLC雖然不受培養(yǎng)時間的限制，具有與原代肝細胞相似的形態(tài)學和功能特征，但是HLC也具有胚胎干細胞的倫理問題、細胞分化不完全和缺乏標準化培養(yǎng)方案等缺點，從而一定程度上限制了相關研究的可重復性[11]。

2 不同培養(yǎng)方式的NAFLD體外模型

2.1 二維細胞培養(yǎng)模型

2.1.1 二維單細胞培養(yǎng)模型 目前為止，大多數(shù)體外研究都利用二維單層肝細胞培養(yǎng)來闡明NAFL所涉及的分子機制。二維單層肝細胞培養(yǎng)技術的優(yōu)點是培養(yǎng)方法足夠成熟，選擇各種細胞和培養(yǎng)方法較為簡單，然而不能長時間(通常為12～48 h)進行細胞培養(yǎng)，未能研究TG長期積累導致的變化，更為重要的是二維單層細胞培養(yǎng)不僅不能代表人類組織的復雜性，還缺乏關鍵的肝細胞-非實質(zhì)細胞相互作用[23]。

2.1.2 二維共同培養(yǎng)細胞模型 在體內(nèi)肝組織的復雜結構中，兩個或多個細胞的相互作用是一種普遍現(xiàn)象，而且肝臟中的非實質(zhì)性細胞如Kupffer細胞和肝星狀細胞在肝細胞的存活和功能中也起重要作用[24]。因此，迫切需要研究NAFLD進展過程中反映細胞間相互作用的體外模型。已有研究[25]表明，原代肝細胞與Kupffer細胞和肝星狀細胞共同培養(yǎng)后，提高了肝細胞活力和功能。Barbero-Becerra等[26]將LX-2肝星狀細胞細胞單獨培養(yǎng)或HuH7肝細胞和LX-2肝星狀細胞共同培養(yǎng)于1200 μmol/L濃度的FFA(棕櫚酸和油酸之比為1∶2)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，建立NAFLD模型，結果提示Huh7肝細胞與LX-2肝星狀細胞共同培養(yǎng)時顯著表達α平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，證明了肝星狀細胞的激活需要細胞間的相互作用。Anfuso等[27]將LX-2肝星狀細胞和Huh7肝細胞獨立培養(yǎng)或共同培養(yǎng)(LX-2肝星狀細胞和Huh7肝細胞之比為1∶5)，分別加入含有1200 μmol/L的FFA(油酸與棕櫚酸之比為2∶1)培養(yǎng)基中96 h，建立NASH模型，然后加入5 μmol/L水飛薊賓一起培養(yǎng)24、96和144 h，發(fā)現(xiàn)活性氧在共同培養(yǎng)模型中減少最明顯，水飛薊賓的抗氧化作用在共同培養(yǎng)中最明顯，從而證明了肝細胞與肝星狀細胞之間的串擾不僅體現(xiàn)在NASH的疾病進程中，而且在治療NASH方面也具有重要意義。Jain等[28]將HepG2肝細胞和LX-2肝星狀細胞(5∶1)共同培養(yǎng)于含有0.75 mmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)基中16 h，建立NASH細胞模型，評估了Saroglitazar、吡格列酮和非諾貝特的藥物作用，發(fā)現(xiàn)Saroglitazar減輕線粒體功能障礙、NF-κB磷酸化和肝星狀細胞的激活方面優(yōu)于另外兩種藥物。二維共同培養(yǎng)細胞模型是將不同類型的細胞放在同一環(huán)境中一起培養(yǎng)，并且可以通過向培養(yǎng)基中添加FFA誘導脂肪變性。因此，二維共同培養(yǎng)細胞模型主要用于研究體外肝細胞與非實質(zhì)細胞之間的相互作用，是研究細胞之間串擾的重要工具。但是缺點是很難實施，操作起來比較復雜。

2.2 三維細胞培養(yǎng)模型

2.2.1 三明治培養(yǎng)模型 為了克服部分單層培養(yǎng)中原代肝細胞功能和形態(tài)的迅速改變，研究人員[9]開發(fā)了三明治培養(yǎng)模型，即肝細胞放置于兩層膠原蛋白凝膠之間，研究發(fā)現(xiàn)肝細胞至少能維持6周的糖原合成和儲存、尿素生成、血漿蛋白合成和分泌、脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運、膽汁酸合成和重攝取，而肝細胞和膠原蛋白在單層培養(yǎng)時，則1～2周內(nèi)停止這種分泌。最近開發(fā)了一種更復雜的三明治培養(yǎng)模型，模擬肝小葉結構，將肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞在膠原蛋白凝膠中共同培養(yǎng)，通過肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞之間的接觸，增強了肝細胞的功能和存活率[29]。然而，在三明治培養(yǎng)模型中，由于膠原蛋白的厚度，細胞與細胞之間的相互作用可能被隱藏或阻塞，因此，三明治培養(yǎng)模型很少用于NAFLD模型[11]。

2.2.2 肝球體 肝球體是目前最常用的三維培養(yǎng)模型。球狀體的形成是由肝細胞的自我聚集引起的，不需要非黏附表面和重力黏附等技術干預。Kozyra等[30]將肝球體(由PHH和少量的Kupffer細胞和星狀細胞組成)與反映NAFLD患者肝臟體內(nèi)環(huán)境的FFA、葡萄糖和胰島素混合液中(濃度分別為320 μmol/L、5.5 mmol/L、0.1 nmol/L)共同培養(yǎng)3周，隨后停止向培養(yǎng)基中加入其混合液，加入不同劑量的抗脂肪變性化合物(如二甲雙胍、胰高血糖素、奧拉帕尼等)共同培養(yǎng)10 d，發(fā)現(xiàn)FFA、胰島素和碳水化合物的混合液促進了肝細胞中脂質(zhì)的積累，增加了脂肪合成基因(脂肪酸合酶)的表達；抗脂肪變性化合物降低了脂質(zhì)含量，進一步證實了脂肪變性的可逆性。另有研究[31]將PHH、肝星狀細胞、Kupffer細胞和內(nèi)皮細胞組成的肝球體加入含有0.5 mmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)基(加入或不加入凋亡信號調(diào)節(jié)激酶-1抑制劑的情況下)中培養(yǎng)9 d，成功建立NASH模型，在此模型中，棕櫚酸顯著增加了α-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶1和血小板衍生生長因子受體β基因的表達，結果顯示凋亡信號調(diào)節(jié)激酶-1抑制劑顯著降低棕櫚酸誘導的NASH的炎癥反應和肝纖維化。Pingitore等[32]將肝球體(HepG2細胞和LX-2細胞之比為24∶1)加入含有500 μmol/L的FFA(棕櫚酸和油酸之比為1∶2)中培養(yǎng)48 h，建立NASH細胞模型(脂質(zhì)的積累、Ⅰ型膠原蛋白的水平升高和α-SMA的表達增多)，隨后將球狀體與利拉魯肽或Elfibranor(治療NASH的臨床試驗藥物)一起培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)利拉魯肽或Elfibranor減輕了NASH表型。類似一些研究也是利用肝球體建立NASH模型，觀察一些藥物對NASH的療效[33]。肝球體可以作為一種有價值的NAFLD體外模型，有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點，可以成為合適的藥物篩選模型。然而，實際操作時很難保持均勻的球體大小，并且會出現(xiàn)球狀簇，限制球體對營養(yǎng)物質(zhì)和氧的吸收，導致細胞死亡。

2.2.3 肝類器官 肝類器官是體外聯(lián)合培養(yǎng)的具有細胞-細胞/細胞-基質(zhì)相互作用的組織特異性細胞的集合，可概括體內(nèi)肝臟的形態(tài)和功能特征。肝類器官與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法相比，具有明顯的優(yōu)勢，即肝類器官可以更緊密地模擬自然生理過程，包括干細胞分化、細胞運動和細胞間相互作用。此外，肝類器官還可以進行廣泛的擴增和培養(yǎng)，并保持其基因組學穩(wěn)定性，從而可以長期保存[34]。Ouchi團隊[35]采用不同濃度的油酸(200、400、800 μmol/L)處理多能干細胞衍生的肝類器官導致脂質(zhì)積累，發(fā)現(xiàn)隨著油酸濃度增加，脂質(zhì)積累也會增加，當采用油酸培養(yǎng)肝類器官5 d后，觀察到了NASH典型表現(xiàn)包括肝細胞的氣球樣變，IL-8、Ⅲ型前膠原氨基端原肽和α-SMA表達的上調(diào)以及膠原蛋白的沉積，隨后加入法尼酯X受體激動劑FGF19藥物2 d后，發(fā)現(xiàn)上述表現(xiàn)明顯改善。Kruitwagen等[36]利用貓肝祖細胞衍生的貓肝類器官加入含有FFA(0.4 mmol/L油酸酯和0.2 mmol/L棕櫚酸酯)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，建立NAFLD模型；并有研究[37]發(fā)現(xiàn)T863(二?；视王；D(zhuǎn)移酶1 抑制劑)以及AICAR(AMPK激動劑)兩種藥物降低脂質(zhì)蓄積，為評估這些藥物用于NAFLD的臨床應用奠定理論基礎。Wang等[38]采用FFA誘導多能干細胞衍生的肝類器官建立了NASH細胞模型，表現(xiàn)為脂質(zhì)積累，上調(diào)脂質(zhì)代謝相關基因(載脂蛋白C2、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶2和肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A)的表達，增加了活性氧、各種炎性標記物(IL-8、IL-6、TNFα、單核細胞趨化蛋白-1)和纖維化標志物(α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白)的水平。肝類器官源自患者組織活檢或多能干細胞，可包含多種細胞類型，具有與原生肝器官類似的結構和功能，已成為研究肝生理學和病理生理學的新型體外工具，通常用于疾病建模和藥物篩選。然而，肝類器官可能會出現(xiàn)細胞分化不完全，不包括肝臟中存在的所有細胞,仍無法表現(xiàn)出完整的肝功能以及血管化、免疫化、神經(jīng)支配等[39]。

2.2.4 肝芯片 肝芯片是一種三維體外肝微生理系統(tǒng)，是模擬肝細胞狀態(tài)和肝動態(tài)理化環(huán)境的高通量系統(tǒng)。肝芯片的微結構是由聚合物支架構成，該支架由數(shù)百個小通道組成。這樣的結構使得當肝細胞被植入這些通道時，肝芯片中的聚合物支架會排列成長長的甜甜圈狀，非常類似于肝小葉，而且將含有各種營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的微流體模擬血流。因此，肝芯片極大地增加了體外模擬NAFLD的可能性，是了解脂質(zhì)代謝異常的重要方法。Gori等[40]利用FFA(0.33 mmol/L棕櫚酸和0.66 mmol/L油酸)培養(yǎng)肝芯片(植入HepG2細胞)48 h，成功建立NAFL模型，該設備模擬了肝竇的內(nèi)皮-實質(zhì)界面，并允許營養(yǎng)成分的擴散和廢物的清除，類似于肝臟的微循環(huán)，反映了NAFLD患者體內(nèi)脂質(zhì)積累過程。Lee等[41]研發(fā)了一種腸-肝芯片，并評價了α-硫辛酸、丁酸鹽、TNFα對脂肪變性的影響，該芯片由腸側(cè)膠原支架多孔膜隔開的兩個腔室組成，Caco-2腸細胞植入腸腔，HepG2肝細胞植入肝腔，加入含有3.8 mmol/L濃度的FFA(油酸和棕櫚酸之比為2∶1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)或其內(nèi)分別加入α-硫辛酸、丁酸鹽、TNFα(濃度分別為2 mmol/L、2 mmol/L、25 ng/ml)培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸降低了芯片中TG積聚；丁酸鹽通過增強腸屏障功能嗎，減少肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積累而減輕了脂肪變性；TNFα使Caco-2腸細胞的屏障功能受損，允許更多的FFA穿過屏障接觸HepG2細胞，從而增加了HepG2細胞脂肪變性。Freag等[42]開發(fā)了一種肝芯片，其包含PHH、肝竇內(nèi)皮細胞、Kupffer細胞和肝星狀細胞，將該芯片培養(yǎng)于含有油酸、棕櫚酸和脂多糖(濃度分別為0.66 mmol/L、0.33 mmol/L、10 μg/mL)的培養(yǎng)基或其培養(yǎng)基內(nèi)加入Elafibranor藥物(過氧化物酶激活α受體和δ受體激動劑)培養(yǎng)10 d，模型組表現(xiàn)出典型的NASH特征，包括細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積、肝細胞氣球樣變、肝星狀細胞活化、炎性標志物(TNFα、巨噬細胞炎性蛋白1α和單核細胞趨化蛋白1)和纖維化標志物(α-SMA、金屬蛋白酶組織抑制因子1和Ⅰ型膠原蛋白)的升高，Elafibranor干預組減少細胞內(nèi)脂質(zhì)約8倍，減少肝細胞氣球樣變約3倍，明顯降低肝星狀細胞活化、炎性和纖維化標志物水平，從而顯著抑制了NASH進展。肝芯片與二維培養(yǎng)相比，通過其微流體動力學體現(xiàn)出更高的肝細胞活力、逐漸降低的細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和較輕的氧化應激；與肝類器官相比，肝芯片有標準化協(xié)議和生物工程制造優(yōu)勢，具有更高的可重復性，然而肝芯片由于復雜度高和成本昂貴，并未得到廣泛應用。

2.3 精密肝切片 精密肝切片(precision-cut liver slice，PCLS)是研究NAFLD機制方面的有效體外模型，PCLS維持了肝臟的細胞構成和組織結構，完整保留了肝藥酶和細胞器的活性，也保留了細胞之間的連接及一定的細胞間質(zhì)，因而更加接近體內(nèi)生理條件。Palma等[43]將人PCLS培養(yǎng)于含有FFA(油酸和亞油酸濃度均為0.1 mmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，模擬了NAFLD早期肝脂肪變性、脂質(zhì)沉積和脂毒性。Prins等[44]將大鼠PCLS加入模擬代謝綜合征的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，其含有葡萄糖、果糖、胰島素和棕櫚酸(濃度分別為25 mmol/L、5 mmol/L、1 nmol/L和240 μmol/L)，結果發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶基因1和2的表達增加，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1基因表達降低，表明早期脂肪變性是通過新生脂肪增加和線粒體β氧化減少而實現(xiàn)的。PCLS的主要局限是切片機價格昂貴，成本高、可重復性差、培養(yǎng)維持時間短和需要新鮮切除的肝組織等。

3 總結與展望

綜上所述，本文總結了近幾年常用的NAFLD體外模型及在研NAFLD體外模型，這些模型為研究者根據(jù)自身研究目的選擇合適的細胞及培養(yǎng)條件提供幫助，為獲得高質(zhì)量研究成果提供保障。相信隨著對NAFLD認識的不斷深入和突破，將會出現(xiàn)更穩(wěn)定、簡單有效、與NAFLD發(fā)病相關的病理生理學模型來促進NAFLD發(fā)病機制及防治藥物的研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：盧曉臣負責分析資料，撰寫論文，修改論文；韓紅梅負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。