空卵泡綜合征的最新研究進展

鄭明明 魏超峰 連方

空卵泡綜合征(empty follicle syndrome，EFS)是一種在體外受精(in vitro fertilization，IVF)過程中經過控制性超促排卵但沒有成熟的卵母細胞被取出的現象。1986年由Coulam等[1]最早報道，在輔助生殖技術的促排卵周期中，卵泡大小和體內激素水平均正常，但通過重復沖洗和操作仍不能從成熟的卵泡中獲取卵母細胞。2008年，Stevenson等[2]首次將這一現象具體分型，提出真性空卵泡綜合征(genuine empty follicle syndrome，GEFS)與假性空卵泡綜合征(false empty follicle syndrome，FEFS)的概念。GEFS比較復雜且預后不佳，是一個受多種因素影響的棘手問題。FEFS通常被認為是由于取卵日β-人體絨膜促性腺激素(β-HCG)較低(<40 mU/mL)導致不能取到卵母細胞，往往由外界因素如人為或藥物使用不當所造成。因此，對于臨床工作者需要在IVF周期中盡量消除諸類因素從而避免FEFS的發生。本文就兩種不同性質的空卵泡的病因、治療、預防及預后等方面進展論述。

一、EFS病因

1. GEFS病因：目前對于EFS病因有很多研究，但確切的機制仍不清楚，研究發現GEFS的發生與以下因素有關。

(1)年齡。對于女性來說，研究顯示[3]生育力與年齡成反比，流產率、畸形率和空卵泡發生率隨著年齡增大也會增加，尤其是年齡大于44歲的女性。據報道GEFS的復發率隨著年齡的增長而增加[4]。Baum[5]回顧性研究了大量EFS患者，包括復發性患者，評估了該群體隨后的生育情況，發現GEFS的出現與年齡增長有密切關系，同時也與某些激素水平的異常相關。

(2)卵巢老化。卵巢功能和卵泡儲備是一個女性生育功能的體現，其生育能力的下降與卵巢功能的變化密切相關，卵巢老化表現出卵泡不斷耗竭的狀態、卵泡池的卵泡數目下降等，這都是生殖能力下降的表現。卵巢作為重要的生殖器官受各種因素的影響[6]：遺傳學因素、免疫因素、醫源性因素和環境因素都可能對卵巢產生損害，在這些諸多不良因素作用下卵巢逐步老化。Zreik[4]認為卵巢老化以及卵泡耗竭的卵泡發育異常可能是導致EFS出現的一個重要因素。

(3)卵巢儲備功能降低。卵巢儲備是評價生育力的一項重要指標，除了竇卵泡數目的減少，卵泡質量的下降也是卵巢儲備功能降低的重要表現，這可能導致在IVF過程中即使對卵巢進行適當的刺激后仍不能從成熟卵泡中抽吸出卵母細胞。Madani等[7]回顧性分析了58例EFS患者，其中48例診斷為GEFS，該研究發現這些患者血清抗繆勒激素(AMH)低，成熟卵泡少。Yakovi等[8]的前瞻性研究也得出同樣的結論，由此分析卵巢儲備低可能是EFS的一種發病原因。但也有研究[9]結論相反，該研究涉及的患者中只有4.25%有卵巢儲備功能(diminished ovarian reserve，DOR)下降，但31.9%的EFS病例有多囊卵巢綜合征和不明原因的不孕癥，且AMH水平為(4.47±3.54)ng/mL，竇卵泡計數(antral follicle count，AFC)為(15.30±8.07)，表明卵巢儲備減少不是EFS的主要因素。

(4)卵母細胞過早閉鎖。卵母細胞的發育需要顆粒細胞支持，Inan[10]利用Affymetrix基因芯片分析復發性EFS患者顆粒細胞(granulosa cells，GC)的全基因表達，發現空卵泡患者的顆粒細胞基因表達出現明顯改變，差異表達基因水平的變化可能預示著其封閉卵母細胞的質量，凋亡基因的異常增加以及與卵泡正常生長的轉錄物的減少都有可能造成卵母細胞的缺失。由此認為GEFS患者的卵母細胞在早期就發生了閉鎖。

(5)基因和遺傳因素。人卵子透明帶(zona pellucida，ZP)是包裹在卵母細胞周圍的一層半透明的由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4四種糖蛋白構成的膜狀結構。由于ZP蛋白的密度、結構和相互作用與卵泡質量有關，所以卵母細胞質量異常可以通過ZP形態和結構的異常來預測。Sun等[11]通過對來自同一家庭的兩位患EFS的姐妹使用HCG和/或GnRHa進行三個周期的標準的卵巢刺激后，通過測試將全外顯子組測序和共分離，發現其均存在ZP1基因突變，進一步分析證實ZP1、ZP2和ZP3蛋白會被突變的ZP1蛋白中斷其之間的相互作用，最終破壞卵母細胞透明帶的形成，由此提出ZP1基因的特定突變可能為EFS的病因。這種觀點在Yuan等的研究[12]中也得到證實，且發現了ZP1基因上新的突變點c.181C>T (p.Arg61Cys)。此外，Dai等[13]又發現了ZP1基因上的6個新的突變點，進一步推測ZP1的缺失可能導致卵母細胞變性或在濾泡穿刺過程中卵母細胞脆性增加，最終導致EFS。Chen等[14]對復發性EFS女性全基因組連鎖分析和全外顯子組測序，發現在ZP3基因上存在 c.400 G>A (p.Ala134Thr) 突變，認為ZP3突變使ZP的組裝受阻和卵丘細胞與卵母細胞之間的通訊受阻，導致卵母細胞變性。Zhou等[15]發現了新的突變點，包括 ZP1中的3個純合突變 (c.1708G>A,p.Val570Met；c.1228C>T，p.Arg410Trp；c.507del，p.His170Ilefs*52)，ZP1中的2個復合雜合突變(c.1430+1G>T，p.Cys478X 和c.1775-8T>C，p.Asp592Glyfs*29)，ZP2中的1個純合突變(c.1115G>C，p.Cys372Ser)，以及ZP3中的1個雜合突變 (c.763C>G，p.Arg255Gly)，并提出ZP1，ZP2和ZP3中的突變可能影響相應的蛋白質表達，分泌和相互作用，從而為EFS提供了新的機制解釋，并擴展了ZP基因突變的范圍，進一步闡釋了ZP基因突變的致病機制。由此認為基因突變的異常對卵泡發育過程中物質表達的影響會對卵母細胞產生不利影響。

Chen等[16]首次報道在同一家系中2例EFS的發生是由于促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor，LHCGR)基因突變導致。最近國內的研究[17]也進一步證實LHCGR基因突變與EFS的關系。也有報道[18]研究發現一個來自中國的非近親家庭的GEFS患者循環LH水平正常，盡管卵巢儲備和反應令人滿意，但在兩次IVF循環后仍未取得卵母細胞，通過檢測發現其和父母LHGR基因皆出現一個新的純合突變，對其信號研究發現該突變對LHCGR在不同濃度下對hCG或LH的反應具有不同的影響，具體而言，在濃度<1 IU / mL時，該突變體被hCG刺激激活，但部分抵抗LH刺激。在較高濃度(>1 IU / mL)下，突變體被hCG和LH激活。這些數據表明，對LHCGR基因突變的篩查可能有助于GEFS患者的診斷。

同時也有研究發現遺傳因素如染色體的異常也會影響女性的生育力。目前可知某遺傳物質如核型異常可影響女性的生育能力，Onalan等[19]報道了2例原發性不育的耳聾姐妹，經過3次IVF或卵泡漿內單精子注射技術的周期，盡管再次注射HCG，且測定其注射日的E2、P、LH無異常，但FES仍然復發。Vujisic等[20]報道一例有過自然流產史的32歲繼發性不孕女性，后雖多次行輔助生殖周期治療包括自然周期和促排卵周期仍不能成功獲得卵母細胞，行染色體核型檢查為2號染色體臂間倒位：46，XX，inv(2)，(p11q21)；男方染色體正常。由此認為遺傳物質缺失導致出現的遺傳體征可能會影響生殖細胞的正常發育功能，這為EFS的遺傳學基礎和不育個體的遺傳學診斷提供了新的證據。

2. FEFS病因：FEFS通常由于人為因素或藥物應用不當導致。積極探究其機理并尋找有效干預措施和解決方法以改變患者結局十分重要。研究發現FEFS發生與下列諸多因素有關。

(1)HCG生物活性異常。卵泡排出需要LH峰的出現，排卵前LH峰會使得卵母細胞產生形態學改變包括卵母細胞重新啟動減數分裂以及顆粒細胞發生黃素化，隨后在卵丘顆粒細胞團擴張和黏液化基礎上卵泡壁破裂、卵子排出。HCG與LH結構及生物活性相似,若使用的HCG的生物活性異常，也會造成卵泡成熟和排卵障礙而導致FEFS的發生。

(2)HCG的用量不當。有學者[21]研究患者的三個IVF周期，在前兩次失敗后第三個周期通過雙重觸發超正常劑量的人絨毛膜促性腺激素(HCG)結合延遲的卵母細胞回收方法來誘導排卵，重組HCG和尿HCG，結局取卵10枚，受精2枚，成胚2枚。排卵需要卵冠丘復合體及顆粒細胞從卵泡壁上脫離，一定劑量的HCG在這個過程發揮重要作用。顆粒細胞上LH受體的適量表達支持著卵泡的發育，這使得LH完全取代FSH作用[22]。若卵泡發育不良，卵母細胞周圍的卵丘早期萎縮退化或出現自發性LH峰均可出現排卵障礙。目前LH峰的正常范圍不確定，使得排卵前注射HCG的最小有效劑量也尚不清楚，當前臨床一般推薦最小劑量為5 000 IU。但在最新的病例報道[23]，1名38歲的女性扳機時不慎使用了2 000 IU的HCG，最終獲得14枚卵母細胞，其中12枚處于MII期，經卵母細胞胞漿內精子注射(ICSI)后9枚受精，形成8個囊胚，PGS顯示有3枚為整倍體，移植1枚D6胚胎，目前為宮內妊娠，此病例提示低劑量的HCG也有可能促進卵母細胞成熟，且受精和妊娠情況良好。

(3)HCG的使用時間不當。臨床一般在注射HCG后34～36 h取卵，過早注射或過遲使用都可能造成顆粒細胞對HCG不能做出恰當的反應，使卵母細胞不能在合適的時間排出，導致錯過最合適的受精時機。雌激素對于排卵也有重要影響，當雌激素達到一定水平后，LH峰沒有采取恰當的抑制措施，則可能會發生卵子“逃逸”，使卵丘復合物從卵泡壁上脫落。不同患者可能對于HCG的作用時間不同，對于需要HCG作用時間較長的仍按常規注射后34～36 h取卵，就可能導致FEFS的發生。Song等[24]在GnRH-拮抗劑方案中，使用促性腺激素釋放激素激動劑扳機后6 h實施了雙觸發給藥，結果獲得11個卵母細胞行IVF。18 h后，7個卵母細胞顯示正常受精，72 h后形成2個胚胎，說明卵母細胞成熟和排卵是時間依賴性過程，需要根據不同患者情況來調整時間間隔。

(4)HCG代謝清除率速度。HCG體內代謝清除速度在不同患者之間是有一定差異的，肥胖患者與正常人群有一定差異。不同給藥途徑的HCG代謝率也不同，當發生FEFS時，還要將這些因素考慮進去。

(5)促排卵方案。促排卵方案與FEFS之間的關系尚不明確。但 Singh等[9]基于醫院的研究中心進行的一項回顧性研究中，對2010年1月至2016年8月的IVF周期進行了研究。GnRH激動劑、拮抗劑和微刺激方案用于IVF周期，結果發現：EFS的發生率為2.38%(47/1 968周期)，其中拮抗劑方案組(占76.59%，36/47)的EFS發生率(6.69%)最高。但關于促排卵方案可能會受到其他因素影響，目前不能確定其與空卵泡的關系。

(6)扳機藥物的影響。關于不同的扳機藥物與FEFS發生的相關性尚存在爭議。Castillo等[25]的大型回顧性研究分析表明，HCG觸發和GnRHa觸發相比，FEFS發生率無顯著性差異(3.5%vs3.1%)。

二、治療及預防

GEFS的病因研究尚未完全清楚，這給臨床的預防與治療帶來了巨大的挑戰，對于卵巢原因及基因異常導致的會出現復發可能性且預后不良者，贈卵可作為一種選擇。Deepika等[26]報道了1名診斷為GEFS的患者，連續2個周期均未獲得卵子，第3個周期中運用了GnRH-a和HCG雙扳機以后，獲得了11枚卵，移植了2枚囊胚，最終成功妊娠及分娩。但該研究僅1例患者，雙扳機能否改善GEFS的結局尚不明確。最近報告了一例復發性EFS患者，在兩個不同的體外受精周期中，使用兩種不同的方案均未獲得卵母細胞，且第二周期在第二次注射HCG補救后，經過24 h后抽吸一側卵巢仍未獲得卵母細胞，提示改變治療方案或重復HCG給藥不太可能改變GEFS的結局[27]。對于人為因素或藥物作用導致的FEFS可從以下方面挽救：

1.再次注射hCG 24～36 h取卵：Revelli等[28]提出HCG的給藥時間是導致取卵周期失敗的重要因素。諸多研究關于取卵日血β-HCG的水平臨界值有不同報道，Stevenson等[2]提出血β-HCG<40 mIU/mL為是否再次注射HCG的判定指標。Christopoulos等[29]報道6名患者在使用GnRHa觸發后發生EFS，5例患者經注射HCG搶救后36 h再次穿刺獲得成熟卵母細胞。

2. 調整穿刺時間：臨床一般在注射HCG后36～40 h取卵，注射HCG與取卵的時間需要合適的間隔以助于卵母細胞在HCG下更充分暴露并對其做出恰當反應使卵母細胞成熟排卵。臨床研究中發現卵母細胞重新啟動減數分裂需要HCG峰值濃度持續14～18 h左右，成熟卵母細胞的獲得則而在HCG峰28 h之后。Sahebkashaf等[30]對108個患者的119個FEFS周期進行分析，正常卵巢刺激取卵失敗后停止采卵，6 h后重新穿刺，取卵成功。有學者[31]提出適當延長HCG暴露時間對于PCOS患者可促使卵母細胞復合物與卵泡壁充分分離促進卵子最終成熟，提高卵子質量和臨床妊娠率。

3. 取卵技術的改善：取卵和撿卵速度要一致，這個對于臨床醫生的實踐技術操作和相互配合提出更高的要求。若穿刺數個優勢卵泡發現無卵子且顆粒細胞少時，應停止操作重新取卵，積極尋找原因采取補救措施以爭取挽救周期。

4. 換用不同批次的HCG：由于HCG的生物活性降低造成的卵泡成熟或排出障礙而發生FEFS的可能與藥品在生產、包裝或儲存中存在偏差有關，因此出現諸類情況可考慮換用不同批次藥物以挽救周期。

三、結語

目前EFS在臨床中是一個棘手問題，受諸多因素影響且復發可能性較大。無論從心理、情感、身體、還是經濟方面對患者來說都是創傷性的。因此，評估患有EFS的患者在未來治療中是很有意義的。現代醫學技術的發展為臨床診療提供了輔助手段以便動態檢測相關激素水平和卵泡發育。基本資料的完善對于醫生和患者都尤為重要，通過對其資料的分析以及建立資料庫與各學科分工來幫助進一步研究GEFS和FEFS，這對空卵泡綜合征的診治和發病機理探究有重大意義。總之，了解EFS病因，掌握EFS的預防措施和有效補救措施是十分必要的，這有利于減輕患者的心理壓力和減少經濟損失、促進醫學進步。由于受影響因素較多使得EFS的研究 仍然困難重重，阻力較大，還要走相當長的探索之路。