高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定高脂作物中的硒形態(tài)

王鐵良， 周曉華， 劉進(jìn)璽， 魏 紅， 張 迪， 郭 潔， 賈 斌， 李慧展， 楊軍勇

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所1，鄭州 450002) (農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(鄭州)2，鄭州 450002) (河南省糧食質(zhì)量安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，鄭州 450002) (河南省科學(xué)器材供應(yīng)中心4，鄭州 450002)

硒是人體必需的微量元素，具有清除體內(nèi)自由基、高抗氧化作用，可以有效地抵御病變，增強(qiáng)免疫力，適當(dāng)補(bǔ)硒對(duì)一些由硒匱乏引起的疾病有一定的改善作用[1-6]。人們常通過(guò)硒營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、硒片、富硒食物等補(bǔ)硒，其中富硒食物因?yàn)楸憬荻玫搅藦V泛的應(yīng)用，因此，富硒大米[7，8]、富硒小麥[9]、富硒香菇[10，11]、富硒靈芝[12]、富硒大豆[13]、富硒豬肉[14]、富硒雞蛋[15]、富硒大豆[16]、富硒甘薯[17]、富硒瓜菜[18]等富硒食品的生產(chǎn)及研究日益成為焦點(diǎn)，不斷地受到人們的推崇。

目前，絕大多數(shù)食品標(biāo)簽、證書及一些食品標(biāo)準(zhǔn)中所涉及到的硒含量均為總硒含量，而食品中的硒包括了無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒，長(zhǎng)期食用含無(wú)機(jī)硒的食物，可能會(huì)引發(fā)一些疾病[19]；而小分子的有機(jī)硒，諸如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等則更有益于人體吸收。因此，面對(duì)市場(chǎng)上參差不齊的富硒產(chǎn)品，需要對(duì)其進(jìn)行硒元素形態(tài)分析來(lái)了解并對(duì)富硒食品進(jìn)行一定的規(guī)范。

我國(guó)是世界上生產(chǎn)芝麻最多的國(guó)家之一。芝麻是一種含油率很高的優(yōu)質(zhì)油料作物，我國(guó)芝麻分布廣泛，食用率高；花生是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，利用途徑多且富硒能力較強(qiáng)的作物，是中國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，食用范圍比較廣；核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，有“萬(wàn)歲子”“長(zhǎng)壽果”“養(yǎng)生之寶”的美譽(yù)，核桃中86%的脂肪是不飽和脂肪酸，有很大的食用價(jià)值。因此，諸如此類高脂作物，營(yíng)養(yǎng)美味，更適宜人們補(bǔ)硒。本文主要是優(yōu)化建立一種富硒高脂作物中硒形態(tài)的提取方法，了解市場(chǎng)上芝麻、花生、核桃等富硒高脂作物中存在的硒形態(tài)。李娟等[20]、張卓等[21]主要研究的花生中的賦存形態(tài)為蛋白態(tài)、多糖態(tài)及脂肪態(tài)，鮮有涉及硒代氨基酸等小分子形態(tài)。因此，本文可為高脂類作物的硒形態(tài)提取提供依據(jù)，并為市場(chǎng)上此類富硒食品的規(guī)范提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硒代半胱氨酸(99%純度)；磷酸氫二銨、硼氫化鉀、氫氧化鉀，碘化鉀、四丁基溴化銨(優(yōu)級(jí)純)；鏈酶蛋白酶；脂肪酶；三(羥甲基)氨基甲烷Tris(分析純)；亞硒酸根、硒酸根、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；甲醇、乙腈(色譜純)；鹽酸、硝酸(優(yōu)級(jí)純)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SA-50液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀，Milli-Q Syhthesis超純水系統(tǒng)，超聲儀，離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱：Agela MP-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：30 mmol/L (NH4)2HPO4+0.5 mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇(甲酸調(diào)節(jié)pH=6.0)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL。

氫化物發(fā)生參數(shù)：載流：10% HCl；還原劑：0.35% KOH+2% KBH4+0.1% KI；紫外消解。

原子熒光參數(shù)：元素?zé)簦何招年帢O燈；負(fù)高壓：300 V；燈電流：90/45 mA；載氣：300 mL/min；屏蔽氣：600 mL/min。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取亞硒酸根[Se(IV)]、硒酸根[Se(VI)]、硒代半胱氨酸(Secys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMecys)、硒代蛋氨酸(Se-Met)等配制成濃度為1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液，再用中間液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品前處理

將富硒花生、核桃、芝麻試樣粉碎均勻，取適量樣品按照NY/T 1285—2007對(duì)樣品進(jìn)行脫脂處理。

將富硒花生、核桃、芝麻試樣粉碎均勻，取適量樣品按照GB 5009.93—2017對(duì)樣品進(jìn)行總硒測(cè)定。

稱取脫脂后的樣品0.1 g放入離心管中，加入6 mL 130 mmol/L的TRIS-HCl緩沖液(pH=7.5),振蕩混勻，加入15 mg鏈酶蛋白酶后混勻，37 ℃超聲振蕩30 min，10 000 r/min高速離心機(jī)離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究比較了用Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm,10 μm)陰離子交換柱和Agela MP-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)反相C18柱來(lái)進(jìn)行分析比對(duì)。實(shí)驗(yàn)中采用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱，使用檸檬酸流動(dòng)相時(shí)不能完全基線分離[22]；使用磷酸氫二胺流動(dòng)相時(shí)，無(wú)論等度還是梯度，分離時(shí)間均未低于15 min，且未完全基線分離，分離色譜圖如圖1所示。采用C18柱時(shí)，等度洗脫條件下可以在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)5種硒形態(tài)的完全基線分離，分離效果明顯強(qiáng)于使用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱。因此采用反相C18柱來(lái)進(jìn)實(shí)驗(yàn)分離，分離色譜圖如圖2所示。

注：1 硒代半胱氨酸；2 硒甲基硒代半胱氨酸；3 亞硒酸根；4 硒代蛋氨酸；5 硒酸根，濃度均為80 μg/L。圖1 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液在梯度a、等度b條件下的色譜圖

注：1 硒代半胱氨酸；2 硒甲基硒代半胱氨酸；3 亞硒酸根；4 硒代蛋氨酸；5 硒酸根。質(zhì)量濃度均為80 μg/L。圖2 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖質(zhì)量

2.2 高脂作物樣品中硒形態(tài)提取方法的優(yōu)化

2.2.1 樣品形態(tài)及酶種類的選擇

本研究以富硒花生Sample1(總硒測(cè)定結(jié)果為1.24 mg/kg)為實(shí)驗(yàn)樣品。稱取該富硒花生鮮樣6份，每份0.2 g，雙平行，加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶+15 mg脂肪酶、15 mg脂肪酶、15 mg鏈酶蛋白酶，分別命名為X-1，X-2，X-3；再稱取該富硒花生脫脂后樣品6份，每份0.1 g，雙平行，加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶+15 mg脂肪酶、15 mg脂肪酶、15 mg鏈酶蛋白酶，分別命名為T-1、T-2、T-3。6組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機(jī)離心10 min，鮮樣上清液先過(guò)C18小柱，再過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)，脫脂樣直接過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)只加了脂肪酶的X-2與T-2均未出峰，而其余4組出峰均為硒代蛋氨酸，且X-1與X-3峰面積基本一致，T-1與T-3峰面積基本一致，同時(shí)T-3峰面積比X-3峰面積略大。選擇使用脫脂后的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，無(wú)需過(guò)C18小柱，無(wú)需加脂肪酶，方便簡(jiǎn)潔。

2.2.2 提取劑種類的選擇

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL 10% HCL、10% HNO3、130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)、0.1 mol/L KOH、超純水、20%甲醇/水、20% 乙腈/水，分別加入鏈酶蛋白酶15 mg和均不加入任何酶，各一式兩份，14組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機(jī)離心10 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加鏈酶蛋白酶的樣品在同等條件下提取到的硒代蛋氨酸均略高于不加酶的，另外發(fā)現(xiàn)加10%HCl、10% HNO3、0.1 mol/L KOH、20%甲醇/水、20% 乙腈/水這5組的都只能提取到少量的硒代蛋氨酸，而加130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)和超純水均能提取到很高的硒代蛋氨酸，且加130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)提取劑的提取效率最高，因此采用130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)作為提取劑。

2.2.3 優(yōu)化Tris-HCL緩沖液的濃度

配制Tris-HCL濃度分別為10、30、50、70、90、110、130、150、170、190 mmol/L ，調(diào)節(jié)pH=7.5。

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL不同濃度Tris-HCL緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，10組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機(jī)離心10 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)，結(jié)果如圖3所示，在Tris-HCL緩沖液濃度達(dá)到130 mmol/L時(shí)，硒代蛋氨酸含量達(dá)到峰值，隨著濃度繼續(xù)增加，硒代蛋氨酸的含量并未增加，因此，選擇130 mmol/L Tris-HCL緩沖液作為提取劑。

圖3 不同Tris-HCL濃度下硒代蛋氨酸的含量

2.2.4 優(yōu)化Tris-HCL緩沖液的pH

配制130 mmol/L Tris-HCL緩沖液，分成6份，分別調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0。

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL上述不同pH的130 mmol/L Tris-HCL緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，6組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機(jī)離心10 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)Tris-HCL緩沖液的pH=7.5時(shí)，提取到的硒代蛋氨酸含量達(dá)到了最大值，因此采用pH=7.5的130 mmol/L Tris-HCL緩沖液提取。

圖4 不同Tris-HCL pH、鏈酶蛋白酶添加量、提取體積、提取時(shí)間下硒代蛋氨酸的含量

2.2.5 優(yōu)化鏈酶蛋白酶的用量

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)緩沖液，振蕩混勻，再分別加入5、10、15、20、25、30 mg鏈酶蛋白酶，6組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機(jī)離心10 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)，結(jié)果如圖4所示，加酶量到15 mg后，隨著酶量的增加，提取到的硒代蛋氨酸含量變化很小，因此，考慮到價(jià)格因素，將采用15 mg加酶量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.6 優(yōu)化提取劑Tris-HCL緩沖液的用量

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入2、4、6、8、10 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機(jī)離心10 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)，結(jié)果如圖4所示，提取體積為6 mL時(shí)，提取到的硒代蛋氨酸含量最高。

2.2.7 優(yōu)化提取時(shí)間

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，5組樣品于37 ℃下分別超聲振蕩提取10、20、30、40、60 min后離心，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)，結(jié)果如圖4所示，超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，已經(jīng)達(dá)到很高的提取效果，且隨著時(shí)間增加，提取效率并未明顯提高，因此，采用30 min作為最終提取時(shí)間。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

配制10、20、40、60、80、100 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)檢測(cè)。其保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表1。結(jié)果顯示該線性方程的線性相關(guān)系數(shù)r均≥0.999 2，檢出限均≤3.0，符合檢測(cè)需求。

表1 5種硒形態(tài)的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 精密度與回收率

本研究以富硒花生Sample1(總硒測(cè)定結(jié)果為1.24 mg/kg)為實(shí)驗(yàn)樣品。進(jìn)行精密度和回收率實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果如表2所示，5種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率在89.8%～100.6%之間，精密度RSD/%(n=7)均不超過(guò)4.0。

表2 花生中硒形態(tài)的精密度與加標(biāo)回收率(n=7)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

在儀器條件最靈敏的條件下，用建立的新方法對(duì)花生、芝麻、核桃的實(shí)際樣品進(jìn)行提取檢測(cè)。結(jié)果如表3所示，樣品中提取到的硒形態(tài)均為硒代蛋氨酸，且硒代蛋氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.0%～96.9%，其中，富硒花生樣品1(總硒測(cè)定結(jié)果為1.24 mg/kg)色譜圖見(jiàn)圖5，根據(jù)保留時(shí)間定性可知該花生中硒賦存形態(tài)為硒代蛋氨酸。由此可見(jiàn)，這些高脂作物中硒的主要成分為硒代蛋氨酸，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法較高的提取率。

表3 市售富硒花生、芝麻、核桃中硒形態(tài)含量

圖5 富硒花生樣品1中硒代蛋氨酸的色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了一種高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定高脂作物中5種硒形態(tài)的方法，該方法可以在10 min內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)5種硒形態(tài)的基線分離，且便于操作、經(jīng)濟(jì)綠色、提取時(shí)間短、提取效率高。目前，鮮見(jiàn)有含油量較高的食品硒形態(tài)的檢測(cè)，本研究可以實(shí)現(xiàn)對(duì)含油量比較高、提取困難的高脂作物中硒形態(tài)的測(cè)定，為富硒食品的測(cè)定提供技術(shù)支持，為市場(chǎng)上富硒食品的規(guī)范化提供一定的參考。