雙酶復合兩步水解法制備玉米降血糖活性肽及其生物活性

趙婉宏， 鄭喜群,2,， 劉曉蘭， 王俊彤,2， 姜彩霞， 李冠龍

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319) (糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心2，大慶 163319) (國家雜糧工程技術研究中心3，大慶 163319) (齊齊哈爾大學食品與生物工程學院4，齊齊哈爾 161006)

糖尿病是一種代謝性疾病，目前主要通過人工合成的藥物來治療糖尿病，長時間服用會出現肝腎功能的損傷、水腫等癥狀，對人體健康有一定的副作用[1，2]。通過遏制餐后高血糖可以預防糖尿病轉化，人體內的α-葡萄糖苷酶可以將淀粉和低聚糖水解成葡萄糖[3]，小腸黏膜上吸收速度加快，引起餐后高血糖。故抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以減少單位時間內葡萄糖產生進而起到降低血糖的作用[4，5]。食物來源的蛋白酶解物及肽類具有易吸收、安全性好等特點，在功能性食品開發上具有潛在價值。Wang等[6]發現燕麥球蛋白肽對α-葡萄糖苷酶具有調節作用，可作用于調節血糖的多個靶點，達到調節血糖的作用；魏睿婷[7]以油用牡丹籽粕為原料，通過體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗制備得到的降血糖肽證實其具有較強的降血糖活性；吳彤[8]通過對核桃活性肽的制備、純化、結構鑒定并利用α-葡萄糖苷酶抑制率實驗驗證核桃活性肽活性，確定其具有明顯降血糖功效。

玉米黃粉是玉米濕法淀粉加工中產量最大、蛋白質最高的副產物，玉米黃粉中含有60%的蛋白質，其中富含大量活性氨基酸，但由于其含有的醇溶蛋白和谷蛋白溶解性差，限制了玉米蛋白在食品工業中的應用。玉米肽是玉米黃粉經蛋白酶水解或微生物發酵后獲得的低分子質量產物。與玉米黃粉相比，玉米肽的水溶性顯著增加并具有促進乙醇代謝[9]、抗氧化、降血壓、抗炎等功能活性[10-12]。目前酶法水解蛋白條件溫和、副產物少，并能保留水解物的營養價值，從蛋白質水解效果和水解物活性角度考慮，雙酶協同水解法比單酶水解法效果要好。

本研究以玉米黃粉為原料分別利用4 種蛋白酶進行單酶水解后，篩選出風味蛋白酶和堿性蛋白酶對玉米黃粉進行分步水解，利用單因素確定最佳酶解時間、溫度、pH、加酶量繼而進行正交實驗得到最優酶解條件，以水解度及α-葡萄糖苷酶為指標考慮兩種加酶順序選取最優組合，并對其水解物通過超濾分級得到不同組分的酶解液，并進行體外抗氧化活性測定及相關性分析，本研究為玉米蛋白水解物在降血糖功能食品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉(蛋白質質量分數56%)、堿性蛋白酶(酶活力200 U/mg)、風味蛋白酶(酶活力30U/mg)；木瓜蛋白酶(酶活力80 U/mg)、中性蛋白酶(酶活力50 U/mg)、α-淀粉酶(酶活力50 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(酶活力50 U/mg)、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷；無水乙醇、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、三氯乙酸、水楊酸、過氧化氫，所有無機試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

ZNCL-GS190×90磁力攪拌鍋，RNF-0460卷式膜多功能小試設備，ZSHW型電熱恒溫水浴鍋，CHRISTALPha型冷凍干燥機，LGR10臺式高速離心機，DL-5型大容量低速離心機，HD-9707電腦紫外檢測儀。

1.3 方法

1.3.1 玉米黃粉的預處理

采用擠壓膨化和去淀粉處理得到預處理玉米黃粉(蛋白質質量分數為80%)[13]。

1.3.2 玉米蛋白的酶法水解

將預處理玉米黃粉按料液比1∶10分散，在堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶最適酶解溫度、添加量和pH下于磁力攪拌鍋內水解5 h。水解結束后100 ℃加熱滅酶20 min，離心取上清液測定水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率，并以此篩選出2個效果較好蛋白酶進行工藝優化。

表1 不同蛋白酶最適酶解條件

1.3.3 雙酶復合兩步水解法條件優化

根據所選蛋白酶進行優化，固定底物含量100 g/L不變，改變反應時間、溫度、pH值和加酶量進行單因素正交實驗，測定不同條件下的α-葡萄糖苷酶抑制率、水解度和蛋白質回收率，來確定兩種酶的最佳反應條件。而后對酶添加順序進行優化，測定不同添加順序下酶解產物α-葡萄糖苷酶抑制率、水解度和蛋白質回收率，以確定玉米降血糖活性肽酶解最佳條件。

1.3.4 不同分子質量水解產物的制備

選用截留分子質量為10、5、1 ku的超濾膜對已制備的酶解液進行超濾處理。截留>10、10～5、5～1、<1 ku 4個組分，超濾壓力為0.1 MPa，溫度為室溫。

1.3.5 不同分子質量水解產物活性測定

1.3.5.1 不同分子質量水解產物α-葡萄糖苷酶體外降血糖活性的測定

體外α-葡萄糖苷酶活性測定采用了吳暉等[14-17]方法并進行適當修改，取3.0 mL磷酸鉀緩沖液(67 mmol/L，pH 6.8)，100 μL的玉米蛋白酶解液(50 mg/mL，抑制劑)，0.5 mL 的PNPG底物溶液(0.01 mol/L),37 ℃保溫5 min后，加入0.5 mL 37 ℃預保溫的α-葡萄糖苷酶溶液(0.4 mg/mL)，于37 ℃水浴下恒溫反應60 min，再以5 mL 質量分數為4%的Na2CO3溶液(0.2 mol/L)終止反應，于400 nm處測定吸光度值(A)，重復3次，取平均值。空白實驗以緩沖液代替玉米蛋白酶解液和酶溶液，對照實驗以緩沖液代替玉米蛋白酶解液。

(1)

式中：A1為添加樣品和酶時吸光度；A2為將酶液換為等體積緩沖溶液時吸光度；A3為將樣品替換為等體積ddH20吸光度；A0為將樣品以等體積ddH20替代，酶液以緩沖溶液替代測定空白組吸光度。

1.3.5.2 抗氧化活性測定

DPPH 自由基清除率的測定：根據文獻[18]并進行適當修改：取2 mL玉米蛋白酶解液(2 mg/mL)，加入2 mL DPPH無水乙醇溶液(0.1 mmol/L)，混合均勻，避光反應30 min，在517 nm處測其吸光值(Ai)；取2 mL玉米蛋白酶解液于試管中,加入2 mL無水乙醇,在517 nm處測其吸光值(Aj)；取2 mL DPPH 無水乙醇溶液(0.1 mmol/L)和2 mL無水乙醇反應作為對比,在517 nm處測其吸光值(A0)。樣品對DPPH自由基的清除率K按式(2)計算。

(2)

還原力的測定：參照文獻[19]并進行適當修改。取2 mL玉米蛋白酶解液(2 mg/mL)，分別加入2 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6，0.2 mol/L)，2 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃水浴下保溫20 min，再加入2 mL質量分數10%的三氯乙酸(TCA)溶液，震蕩搖勻后以4 000 r/min離心10 min。取離心后上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL質量分數為0.1%的FeCl3溶液，震蕩搖勻后在50 ℃水浴下保溫10 min，波長700 nm下測定吸光值。以去離子水代替樣品重復操作作為空白。

清除羥基自由基(·OH)活性的測定，根據文獻[20]并進行適當修改。取2 mL玉米蛋白酶解液(2 mg/mL)，依次加入2 mL FeSO4(6 mmol/L)、H2O2(6 mmol/L)，混勻靜置10 min，加入2 mL水楊酸(6 mmol/L)混勻，靜置30 min，在510 nm處測定吸光值(Ai)。用去離子水代替水楊酸重復操作，測定510 nm處的吸光值(Aj)，用去離子水代替樣品重復以上操作測定510 nm處的吸光值(A0)。0.01mg/mL的VC溶液作為對照。樣品對羥基自由基的清除率Y按式(3)計算。

(3)

1.4 數據處理與分析

所有實驗均設置3組平行，數據用平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 25和Excel 2020對數據進行顯著性分析及相關性分析，采用Design Expert 11進行響應面分析，以P<0.05表示差異顯著，使用Origin 2019b進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶選擇

由于不同蛋白酶的酶切位點及作用方式不同[21,22]，其玉米蛋白酶解產物對α-葡萄糖苷酶抑制率強弱也有很大的差異，小分子肽在被人體吸收后才具有一定的生理活性，要富集小分子肽，就必須基于一定的水解程度。本實驗參考李佳等[23]的研究，選取4種經驗證效果較好的蛋白酶分別對玉米黃粉進行水解。由圖1可以看出，各種酶的水解液都有一定的α-葡萄糖苷酶抑制效果，且具有顯著的差異性(P<0.05)，木瓜蛋白酶水解液的抑制率只有17.61%，而堿性蛋白酶水解液則高達51.34%。這是由于每種酶作用的位點不同，生成肽段的結構和數量不同。風味蛋白酶主要通過內切蛋白酶切斷多肽內部的肽鍵，形成短鏈肽[24]。堿性蛋白酶水解具有芳香族或疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等)的羧基側鏈，水解能力較強。篩選得到效果較好的堿性蛋白酶和風味蛋白酶，用于優化制備高活性的玉米降血糖肽。

圖1 不同蛋白酶水解物對α-葡萄糖苷酶抑制率

2.2 雙酶水解工藝優化

2.2.1 堿性蛋白酶水解條件優化

采用100 g/L的底物含量，以溫度60 ℃、pH 8.5、加酶質量分數2%和反應時間2 h為初始酶解條件進行單因素實驗[25]，考察溫度、pH、加酶量和時間對玉米蛋白水解物對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。而后縮小各因素的變化水平進行L9(34)正交實驗，確定適宜酶解條件。此外，可溶蛋白含量的測定可反映玉米蛋白粉在酶解過程中的得率，在實際加工中具有重要的經濟意義。而水解度可反映玉米蛋白粉的水解情況，探討其與α-葡萄糖苷酶抑制活性與可溶蛋白含量之間的關系具有重要意義，因此在條件優化過程中測定了玉米蛋白水解產物的可溶蛋白含量和水解度。由圖2可知，堿性蛋白酶是一種內切肽酶，優先水解疏水性且分子質量較大的蛋白質或肽，而玉米蛋白中含有較多的疏水性氨基酸。反應時間在2 h時，蛋白水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率達到最大值為44.58%，2 h后，酶解過程中有活性部位的端基氨基酸被切斷，活性肽鏈長度縮短，氨基酸組成發生了改變，從而使得抑制率明顯降低[26]。加酶量為1.5%時抑制率達到37.17%，且此時酶解產物中的可溶蛋白含量以及水解度均趨于平緩，這說明在酶的高速催化下，玉米蛋白中的肽段被快速水解下來，而隨著酶解反應的進行，可作用的肽鍵減少[27]。

pH對酶活力的影響在過酸或過堿都會造成酶本身空間結構的破壞，甚至引起酶失活，另外，pH值還可能改變底物的解離狀態，影響底物和酶的結合，影響水解效果，從而造成酶活力的下降[28]，pH為8.5時，水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率達到最高52.05%。溫度50 ℃時α-葡萄糖苷酶抑制率達到62.45%，這是由于酶在最適溫度反應活性最強，超過酶的最適溫度后，酶分子的空間結構由于溫度的增加而發生改變，導致酶活性減弱或喪失，從而影響催化效果[29]。

圖2 堿性蛋白酶單因素實驗結果

2.2.2 堿性蛋白酶水解玉米蛋白的正交實驗

堿性蛋白酶正交實驗因素水平和結果分別見表2、3，方差分析見表4。

表2 正交因素水平表

表3 堿性蛋白酶水解玉米蛋白的正交實驗設計及結果

由表3綜合考慮各方面因素，本研究選擇最佳組合為A2B3C2D2，即酶解溫度50 ℃、pH 8.5、加酶量2%(V/m)和反應時間2 h。在此組合條件下，玉米蛋白水解液的α-葡萄糖苷酶抑制率為75.94%，可溶蛋白含量為66.23 mg/mL。由表4可知，各因素對水解物α-葡萄糖苷酶抑制率及水解度、可溶蛋白含量均具有顯著性影響。

表4 方差分析表

2.2.3 風味蛋白酶水解條件優化

采用100 g/L的底物含量，以溫度50 ℃、pH 6、質量分數4.5%100 g/L和反應時間3 h為初始酶解條件[25]，考察溫度、pH、加酶量和時間對玉米蛋白水解物對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。而后在單因素實驗的基礎上進行L9(34)正交實驗，確定風味蛋白酶水解玉米蛋白制備降血糖蛋白水解物的適宜條件。由圖3可知，反應時間在3 h時，蛋白水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率最大。隨酶解時間的延長，抑制率呈下降趨勢，可能是蛋白酶酶解時間過長，活性部位的末端氨基酸被切斷，活性肽鏈長度縮短，氨基酸組成發生了改變[30]，導致水解液的α-葡萄糖苷酶抑制率明顯降低。不同加酶量下，當酶解達到飽和狀態時反應速率由底物質量分數決定，繼續增加酶量對水解度的影響不大[31]，當質量分數為5.5%時，蛋白酶解物α-葡萄糖苷酶抑制率達到最大值為50.21%。溫度在50 ℃時，α-葡萄糖苷酶抑制率達到59.20%。這是因為在酶的最適溫度反應活性最強，超過酶的最適溫度后，酶分子空間結構由于溫度的升高而發生改變，導致酶活性減弱或喪失，影響催化效果。pH對酶活力的影響表現在過酸或過堿都會造成酶本身空間結構的破壞[32，33]，導致酶活降低，當pH為6.5時，水解物的 α-葡萄糖苷酶抑制率達到最高值37.50%。

圖3 風味蛋白酶單因素實驗結果

表5 正交因素水平表

由表6所示，綜合考慮各方面因素，本研究選擇最佳組合為A3B2C2D2，即酶解溫度為50 ℃、pH 6.5、質量分數5.5%和反應時間4 h。在此組合條件下，玉米蛋白水解液α-葡萄糖苷酶抑制率為61.29%，可溶蛋白含量為36.43 mg/mL。由表7可知，各因素對水解物α-葡萄糖苷酶抑制率及水解度、可溶蛋白含量均具有顯著性影響。

表6 風味蛋白酶水解玉米蛋白的正交實驗設計及結果

表7 方差分析表

2.2.4 堿性蛋白酶和風味蛋白酶協同水解玉米蛋白條件

通過改變2種蛋白酶的作用順序對玉米蛋白進行水解，考察酶解順序對酶解效果的影響。在單因素得出的適宜條件基礎上，采用雙酶復合水解玉米蛋白的方法制備降血糖活性更高的蛋白水解物。從圖4可以看出，雙酶協同水解玉米蛋白與單酶水解的情況相比，蛋白水解物的水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率均有提高。這是因為雙酶對玉米蛋白水解比單酶更加充分，增加了蛋白酶的作用位點，玉米蛋白水解更加徹底使得更多具有活性的小分子多肽游離釋放出來。酶解210 min后風味+堿性蛋白酶α-葡萄糖苷酶抑制率及水解度開始提高，顯著高于堿性+風味蛋白酶，得到了較強α-葡萄糖苷酶抑制率的玉米蛋白水解物。這是因為風味蛋白酶是外切蛋白酶，酶解后加入堿性蛋白酶是內切蛋白酶，其對疏水性肽鍵具有優先水解作用，因此可水解出具有疏水性氨基酸末端的肽段，玉米蛋白在其作用下繼續水解，致使肽鍵更加充分斷裂[34]，從而使得肽鏈暴露出降血糖的氨基酸集團，使得玉米蛋白水解物α-葡萄糖苷酶抑制效果增強。

圖4 不同加酶順序對玉米蛋白酶解物降血糖活性的影響

2.3 超濾分離組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性

利用最佳水解條件風味-堿性蛋白酶制備的酶解產物經超濾分離的4個不同相對分子質量肽組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性如圖5所示。風味+堿性蛋白酶酶解玉米黃粉的水解物中的降血糖抑制肽多為小分子質量短肽，對水解液進行分級處理，獲得α-葡萄糖苷酶抑制率較高的組分。在超濾過程中可溶蛋白被超濾膜截留所以導致超濾組分中可溶蛋白含量逐級減少。超濾獲得的四個肽組分與玉米蛋白酶解物相比均表現出α-葡萄糖苷酶抑制活性，<1 ku組分顯示出較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

注：對照為風味-堿性蛋白酶水解物。圖5 不同超濾組分的α-葡萄糖苷酶抑制率

2.4 超濾分離組分的抗氧化性

利用最佳水解條件風味-堿性蛋白酶制備的酶解產物，對經超濾分離的4個不同超濾肽組分進行抗氧化活性測定，如圖6所示。超濾后的玉米蛋白酶解液四個肽組分都具有抗氧化活性，<1 ku組分的抗氧化活性顯著高于其他組分(P<0.05)。其中<1 ku組分的還原力高達(0.181±0.003)，羥自由基清除率達到(76.72±1.48)%，DPPH自由基清除率達到(52.56±1.62)%。研究結果表明風味+堿性蛋白酶酶解玉米黃粉的水解物中的降血糖抑制肽同時也具有抗氧化活性，且1 ku以下組分抗氧化活性較好[35，36]，這說明具有活性的多肽主要集中在小分子多肽中[37]。

圖6 不同超濾組分的抗氧化活性

3 結論

以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標，對堿性和風味蛋白酶協同水解玉米蛋白的條件進行研究。研究結果表明堿性蛋白酶最適條件為：酶解溫度50 ℃、pH 8.5、質量分數2%和反應時間2 h。風味蛋白酶最適條件為：酶解溫度50 ℃、pH 6.5、質量分數5.5%和反應時間4 h。優化加酶順序得到風味蛋白酶+堿性蛋白酶所得水解物的α-葡萄糖苷酶抑制率高達81.38%。水解物經超濾后被分為>10、10～5、5～1、<1 ku 4個組分，對分離組分測定α-葡萄糖苷酶抑制率，發現<1 ku組分的α-葡萄糖苷酶抑制率最高，為90.87%，且具有較高的抗氧化活性。