響應面優化竹葉黃酮酶法酯化及抗氧化評價

羅洪杰， 史波波， 王思懿， 祝佩瑤， 許 江， 錢俊青

(浙江工業大學藥學院，杭州 310000)

竹葉黃酮是我國盛產的天然酚類化合物，具有多種生物活性，在抗菌、清除自由基、抗突變、清熱解毒、調節血脂等方面均具有效果，抗氧化性較強[1-3]，是國家批準使用的食品抗氧化劑。目前，對竹葉黃酮的生理功能及抗氧化性能已開展了較為深入的研究[4]，黃酮含量較高的產品生理功能較強，特別是抗氧化性能有較大提升[5]。黃酮類化合物的自由基清除和抗氧化能力強弱取決于黃酮的類型和結構[6]。張英等[7]研究了12種黃酮單體清除自由基的能力，結果表明，12種黃酮均有清除自由基的能力，7種竹葉黃酮除含量較低的甲氧基牡荊苷外，其余6種清除和抑制活性氧自由基的能力超過或相當于槲皮素，表明竹葉黃酮的抗氧化活性超過銀杏葉黃酮。

楊國棟等[8]通過鄰苯三酚自氧化體系、鄰二氮菲—Fe2+體系、自由基(DPPH)體系以及 H2O2誘導紅細胞溶血體系對竹葉黃酮單體葒草苷和牡荊苷抗氧化活性進行研究，結果表明葒草苷能夠清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基，保護紅細胞，一定濃度范圍內呈良好的量效關系。牡荊苷也具有抗氧化活性，但清除自由基能力較葒草苷弱。Shibano等[9]采用DPPH清除自由基方法測試了12種黃酮單體的抗氧化能力，其中竹葉黃酮單體異葒草苷，葒草苷清除自由基的EC50為6.2～6.7 μg/mL，抗氧化能力較為突出。

竹葉黃酮抗氧化性能優異，作為食品抗氧化劑非常理想。但竹葉黃酮以糖苷的形式存在，多羥基及糖基結構，具較好的親水性，油溶性較差[3]，因此，應用于油脂中進行抗氧化比較困難。我國是植物油消費大國，植物油所含的不飽和脂肪酸在儲運中易氧化，嚴重影響油脂品質與食用安全性。目前商品植物油的抗氧化基本采用化學抗氧化劑，安全性不及天然抗氧化劑高，因此解決竹葉黃酮應用于植物油抗氧化的困難十分必要。同時竹葉黃酮產品的穩定性不夠高，在儲存中易氧化變質，也是需解決的重要問題。

植物黃酮可與脂肪酸或芳香酸在脂肪酶催化下直接發生酯化反應[10,11]。黃酮酯化后，不僅能提高其在油脂中的溶解性，也可增加儲存穩定性[12]，作為植物油抗氧化劑應用十分有利。酶催化反應條件溫和，可保持植物黃酮的分子結構不變，不影響其抗氧化等生物活性[13,14]，因此，開展酶催化竹葉黃酮酯化研究，可克服竹葉黃酮油溶性差的缺陷，有助于提高竹葉黃酮的儲存穩定性。我國竹葉黃酮資源豐富，酶法酯化竹葉黃酮的研究開發具有理想的應用前景。

本實驗以棕櫚油為酰基供體，研究了竹葉黃酮與棕櫚油的酶催化酯交換工藝。以曲面響應法優化酯化工藝條件，并采用石油醚和乙醇水溶液分別萃取回收未反應的棕櫚油和竹葉黃酮，采用鄰二氮菲Fe2+氧化法評價了竹葉黃酮酯的抗氧化活性，可為竹葉黃酮在油脂中的開發和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹葉黃酮(總黃酮質量分數43.0%)，Novozym?435脂肪酶，異葒草苷標準品，葒草苷標準品，牡荊苷，異牡荊苷，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷標準品(純度98.0%)；維生素C、維生素E、棕櫚油、叔戊醇等試劑均為分析純；分子篩的有效孔徑為0.4 nm。

Agilent 1200 series高效液相色譜儀，752型紫外可見光度計，ULUP-I-微量分析型超純水機，R-201型旋轉蒸發儀。

1.2 黃酮酶催化酯化方法

以竹葉黃酮(總黃酮質量分數43.0%)和棕櫚油為反應底物，在50 mL錐形瓶中加入竹葉黃酮、棕櫚油、脂肪酶，及經300 ℃活化6 h的0.4 nm分子篩，以干燥的叔戊醇為反應溶劑，在水浴中保溫振蕩反應，黃酮的酯化率作為指標，考察脂肪酶的種類、酶的用量、底物濃度比、酯化溫度與時間、溶劑用量和分子篩的用量。通過單因素實驗確定的酯化條件為：底物為0.45 g竹葉黃酮(43.0%)、2.0 g棕櫚油、0.2 g Novozym 435脂肪酶，2 g 0.4 nm分子篩，反應溶劑叔戊醇15 mL，在60 ℃、210 r/min條件下振蕩反應72 h，酯化率達30.0%。在此基礎上，以響應面法優化酯化工藝。

1.3 黃酮酯的純化方法

竹葉黃酮與棕櫚油酯化反應完成后，回收未反應的黃酮及棕櫚油，純化竹葉黃酮酯。參考文獻方法[15]，在酯化反應完成后將反應液真空旋轉蒸餾，回收叔戊醇，固形物加入石油醚，萃取未反應的棕櫚油，然后將萃取液離心分離，上清液真空旋蒸至干，稱重，以石油醚萃取的棕櫚油量計算除油率，通過液相色譜法檢測計算竹葉黃酮酯的回收率，以除油率和回收率綜合考察除油工藝。

將上一步離心得到的固形物采用95%乙醇溶解，離心去除沉淀，上清液真空蒸餾回收95%乙醇，固形物用乙醇水溶液萃取回收竹葉黃酮，萃取的油狀物為竹葉黃酮酯。通過液相色譜法檢測萃取純化的竹葉黃酮酯純度，并計算純化的回收率，以黃酮酯的純度和回收率考察萃取純化工藝。

1.4 抗氧化實驗方法

參考文獻[16,17]，選擇檢測比較穩定的鄰二氮菲Fe2+氧化法開展純化的竹葉黃酮酯抗氧化性能評價。取0.2 mL 5×10-3mol/L鄰二氮菲和1 mL 50×10-3mol/ L Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)于5 mL具塞比色管中，加入0.2 mL 7.5×10-3mol/L FeSO4溶液，立即搖勻后，加入200 μL質量濃度相同的樣品溶液，然后再加入0.2 mL l %的H2O2溶液，乙醇定容。充分搖勻后，37 ℃水浴中保溫60 min，測定溶液在536 nm處的吸光度值。其清除率按公式計算：

清除率=[(A2-A3)/(A1-A3)]×100%

式中：A1為不加H2O2和樣品時的吸光度；A2為加入H2O2和樣品時的吸光度；A3為加入H2O2，但不加樣品時的吸光度。

1.5 竹葉黃酮與黃酮酯液相色譜檢測方法及黃酮酯色譜質譜聯用檢測方法

采用C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動相：A(乙腈)和B(0.3%乙酸水)，梯度洗脫條件為0 min(10∶90)，25 min(100∶0)和35 min(10∶90)，進樣量為20 μL，流速為0.7 mL/min，檢測波長為330 nm[16]。以竹葉黃酮單體的標準品對照定性，混合黃酮酯的面積歸一法進行純度定量，混合黃酮酯總面積比較計算純化工藝回收率。

黃酮酯HPLC色譜分離洗脫, 產物經陽離子源(ESI) 通過飛行時間質譜 (Agilent 6210 TOFMS，America)，電離模式采取陰離子模式，氮氣流速4L/min, 30 psi 噴霧器壓力，溫度300 ℃，全掃描m/z50～1 500之間。

2 結果與討論

2.1 竹葉黃酮原料及反應產物的檢測

如圖1所示，經6種竹葉黃酮組分單體的標準品色譜圖比對，其中含量較高的組分2和組分3分別為異葒草苷和葒草苷，組分1為葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷，保留時間20 min的組分為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷。在保留時間30～33 min的含量較高的組分為牡荊苷及異牡荊苷，而保留時間45～55 min的峰是竹葉黃酮產品共存的其他竹葉成分，與文獻[18]報道的竹葉黃酮組分一致。色譜檢測表明，質量分數為43.0%的竹葉黃酮中6種組分齊全，對照文獻[4,5]，各組分含量比例適宜，適合作為酶催化酯化研究的原料，可合理評價酯化得到的黃酮酯的抗氧化性能。

圖1 竹葉黃酮的液相色譜圖

酯化反應產物液相色譜檢測結果如圖2所示。保留時間為20～30 min的峰為竹葉黃酮酯混合產物。對其中含量最高的異葒草苷棕櫚酸酯進行液相色譜與質譜聯用檢測，結果如圖3所示。質譜圖體現的分子質量符合異葒草苷棕櫚酸酯的分子質量。圖3表明，以棕櫚油為酰基供體，脂肪酶催化竹葉黃酮可順利進行酯化反應。

圖2 竹葉黃酮和棕櫚油的酶催化酯化產物色譜圖

圖3 異葒草苷棕櫚酸酯的HPLC-MS分析圖

2.2 黃酮酯化工藝響應面優化

2.2.1 單因素的方差分析

酯化工藝單因素確定后，通過F檢驗法對各單因素進行方差分析，評價其顯著性。計算結果見表1，其中F>F臨界值，P<0.001，則表示該因素對工藝有顯著影響。除反應時間和溶劑用量外，其他因素均對黃酮酯化率有顯著的影響。

表1 酯化工藝單因素的方差分析

2.2.2 PB實驗設計及結果處理

在工藝單因素方差分析的基礎上，考慮到酶的種類并不是本次實驗的研究重點，故選顯著性較強的其他4個因素作為PB設計的研究因素[19]，每個因素取兩水平：高水平(+)和低水平(-)，以酯化率為考察指標。選取的各因素的水平如表2，M=4的PB實驗設計和實驗結果見表3。應用Design-Expert(8.01)軟件對實驗結果進行統計分析，計算結果見表4，P-value<0.01為顯著的因素，從表4中可以看出，棕櫚油的使用量為最顯著的因素，溫度和加酶量為較顯著的因素，與文獻報道的黃酮酶催化酯化影響因素相似[20,21]，因此以這3個因素作為響應面實驗的單因素。

表2 PB實驗設計各因素的水平

表3 PB實驗(M=4)設計與結果

表4 ANOVA分析因素模型

2.2.3 響應面實驗設計和結果分析

根據PB實驗結果，以酯化率為響應值，篩選得到溫度、酶添加量，棕櫚油添加量3個因素，每個因素取兩水平：高水平(+)和低水平(-)，實驗設計及結果見表5。

表5 響應面分析實驗及結果

經Design-Expert 8.0.6軟件處理，采用一次型進行變異分析(Analysis of value，ANOVA)，其方差分析的結果見表6，對各因素與響應值進行回歸擬合，得出模型對應的回歸方程為：

酯化率=0.403 50A+44.050 00B+4.360 00C-10.547 21

表6 回歸模型方差分析

由表6可以看出，以酯化率為響應值時，模型P=0.000 7<0.01，表明回歸方差模型極顯著，失擬項P值為0.880 7>0.05，不顯著。所以該模型的擬合度較高，說明實驗所得方程能較好地對響應值進行預測。此外該模型的決定系數R2=0.718 5，表明預測值與真實值有較高的相關性。根據文獻[22]，相對較低的變異率(CV=3.2 %)說明實驗的可操作性較好。因此，該模型可較好地分析和預測各因素變化時酯化率的真實情況。

若采用二次型進行變異分析，模型P=0.054 9>0.05，不顯著，表明二次型不適用于本實驗的變異分析。考察各因素之間交互作用的響應面及等高線圖，結果表明溫度與酶添加量(AB)、溫度與棕櫚油添加量(AC)、酶添加量與棕櫚油添加量(BC)之間的交互作用均不明顯，與方差分析結果相符。

根據回歸模型，求得最佳的單因素條件為：A=60，B=0.25，C=2.0。即：反應溫度60 ℃，脂肪酶的用量為0.25 g，棕櫚油的用量為2.0 g，酯化率的預測值為33.39%。為了驗證模型方程的有效性，進行了優化條件的驗證實驗，重復3次的平均酯化率為(33.13±2.0)%，實驗值與預測值吻合情況較好。可見該模型可以用于竹葉黃酮的酶法酯化優化，證明該模型是合適的，有指導意義。與文獻[23,24]報道的植物黃酮酶催化酯化工藝比較，具有較好的酯化效果。

2.3 竹葉黃酮酯的純化

2.3.1 萃取棕櫚油工藝石油醚用量考察

酯化反應結束后，以產物的質量和石油醚體積的比作為因素考查了萃取除油回收棕櫚油工藝，實驗結果如圖4所示。隨著石油醚體積的增大，除油率逐漸下降，但回收率則逐漸回升，當產物的質量和石油醚體積的比為12∶100時，除油率為95.5%，黃酮酯回收率為88.9%。2個指標均比較理想，故選取12∶100作為黃酮酯石油醚萃取除油的條件。

圖4 石油醚的用量對除油率和黃酮酯回收率的影響

2.3.2 萃取竹葉黃酮的乙醇水溶液濃度確定

除油工藝確定后，考察了不同濃度的乙醇水溶液萃取回收殘留竹葉黃酮的效果，除油的黃酮酯化產品質量70 mg，乙醇水溶液體積為10 mL，萃取實驗結果如圖5所示。隨著乙醇濃度的增加，產品的純度不斷提高，但回收率則逐漸下降。當乙醇體積分數為30.0%時，黃酮酯的純度達到84.4%，回收率達到82.1%。兩個指標較理想，故以此乙醇水溶液濃度確定為萃取竹葉黃酮的條件。

圖5 乙醇濃度對產品純度和回收率的影響

根據實驗結果，竹葉黃酮酯純化方法確定為：酯化反應結束后，將產品真空旋干，回收叔戊醇，7.7 g產物加入石油醚100 mL，50 ℃溫度下210 r/min振蕩30 min，萃取未反應的棕櫚油，以5 000 r/min離心分離，上清液為石油醚棕櫚油層，固形物為竹葉黃酮與黃酮酯混合物，除油率為95.5%，黃酮酯回收率為88.9%。

將上一步得到的固形物用95%乙醇溶解，離心去除沉淀(包括酶和分子篩)，95%乙醇真空旋蒸回收后，按1 g固形物用30.0%的乙醇溶液150 mL的比例加入乙醇溶液，在50 ℃，210 r/min條件下振蕩30 min后，分離上清液，而固形物即為黃酮酯。得到的竹葉黃酮酯經檢測純度達到84.4%，回收率為82.1%，純化產品作為抗氧化評價樣品。

2.4 竹葉黃酮酯抗氧化評價

對竹葉黃酮(AOB)，竹葉黃酮棕櫚酸酯(AOB-PALM)與維生素C(VC)和維生素E(VE)進行抗氧化性能評價。以鄰二氮菲Fe2+氧化法測定了四種抗氧化劑的自由基清除能力，半數清除率(IC50)表示抗氧化能力的強弱，結果如圖6所示。竹葉黃酮酯產物比竹葉黃酮的自由基清除率有所下降，但仍具有較強的抗氧化活性，IC50介于維生素C和維生素E之間，與報道的竹葉黃酮抗氧化研究文獻比較[25,26]，抗氧化評價結果類似，表明竹葉黃酮酯化產品的抗氧化性能保持良好。

圖6 VC，VE，竹葉黃酮及黃酮棕櫚酸酯的半數清除率IC50值

3 結論

以棕櫚油為酰基供體，脂肪酶催化竹葉黃酮酯化，通過單因素考察和響應面優化，確定酯化的工藝條件為總黃酮質量分數為43.0%的竹葉黃酮0.45 g、棕櫚油2.0 g，Novozym?435脂肪酶0.25 g，0.4 nm分子篩2 g，加入15 mL干燥的叔戊醇于50 mL錐形瓶中，在60 ℃，210 r/min條件下振蕩反應時間72 h，酯化率達(33.1±2.0)%。

竹葉黃酮酯化反應完成后，分別采用石油醚和30.0 %的乙醇水溶液萃取回收未反應的棕櫚油和竹葉黃酮，純化得到的竹葉黃酮酯純度達84.4%，回收率為82.1%。

酶催化棕櫚油為酰基供體酯化竹葉黃酮，可有效提高竹葉黃酮的脂溶性，較好保留了竹葉黃酮的抗氧化活性，可作為食品抗氧化劑在植物油中應用。