不同滅酶條件下油體得率、成分的變化及油體性質分析

孫 婕， 劉亦菲， 尹國友

(河南城建學院生命科學與工程學院，平頂山 467036)

大豆營養價值豐富，是世界上一種重要的油料作物，可為人類膳食提供優質的蛋白質和油脂。大多數植物種子在油體內儲存脂類物質[1，2]。油體，也稱為類脂體，是儲存類脂物質的亞細胞器顆粒，是一種直徑為0.2～0.5 μm 的球體，主要由三酰甘油酯(TAG)、磷脂(PL)和油體相關蛋白組成[3]。大豆油體(SOB)富含對人體健康有益的脂溶性生物活性物質，如磷脂、生育酚、異黃酮、多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質、脂質等物質[4]。此外，大豆油體是來源于大豆的預乳化油的天然來源，可以分散在水介質中形成穩定的乳化體系[5]。由于其特殊的結構、有益的功能成分及良好的穩定性，在食品、美容和醫藥保健領域具有廣闊的應用前景。

由于大豆油體特殊的結構、有益的功能成分及良好的穩定性，近年來，對于油體的研究越來越多，特別是在油體結構、理化性質、應用領域等方面，例如，傅禮瑋等[6]以大豆油體為主要原料，作為乳化劑，將其固體脂肪含量調整到適合于攪打稀奶油體系，并對大豆基攪打稀奶油理化性質進行研究，為天然稀奶油的制備提供了有力依據。居巧苓等[7]將生豆漿調酸處理，實現大豆油體富集物的分離，制得低脂大豆蛋白液。何勝華等[8]研究了大豆和油菜籽油體形成的天然乳液，并考察了2種油體乳液在環境應力下的穩定性和在胃腸道消化過程中的微觀變化。韓昊天等[9]以大豆油體富集物為天然乳化劑，研發并優化了一款新型乳品，為未來大豆油體富集物在乳制品中的應用提供依據。

提取大豆油體過程中會產生許多副產物如豆渣和脫脂豆漿，這些副產物在實際生產排放到環境中會造成嚴重的污染。因此，有必要對大豆油體提取過程中產生的副產物進行研究和開發。本文首先對大豆或豆漿進行了不同條件下的熱處理，在不同滅酶處理的基礎上提取大豆油體，對不同條件下大豆油體得率進行計算、測定其基本成分、穩定特性和流變性質，旨在確定大豆油體提取的最佳滅酶熱處理工藝。在此基礎上，對提取品質綜合評定較高的大豆油體進行應用分析，即探索大豆油體在不同pH、NaCl濃度、溫度、加水量處理條件下的穩定性和流變性，還對大豆油體提取過程中產生的豆渣、脫脂豆漿進行基本成分的測定，這為大豆油體應用時的加工工藝、質量穩定控制和設備設計，以及豆渣和脫脂豆漿的再利用等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆，蔗糖、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、石油醚、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、甘氨酸、Tris、Acrylamide、TEMED、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍、甘油、溴酚藍、甲醇、醋酸。

1.2 儀器與設備

DC10-K10超級恒溫水浴鍋，YN6-0.7-D全自動電加熱蒸汽發生器，DS-1高速組織搗碎機，華燁HYP-308消化爐，華燁KDN-103F自動定氮儀，DHG-9053A電熱恒溫鼓風干燥箱，DL-10MD大容量高速冷凍離心機，ULTRA-TURRAX高速分散機，Mastersizer2000激光粒度儀，Nano ZS電位及納米粒度分析儀，HAAKE MARSⅢ流變儀，Mini-PROTEAN Tetra cell電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 大豆油體制備

參照Chen等[10]的水提法并略作改動。用去離子水浸泡大豆10～12 h后，按照大豆比水1∶3的比例加入去離子水于高速組織搗碎機中進行磨漿，磨漿后進行漿渣分離得到豆漿，然后按照豆漿與蔗糖質量比4∶1的比例加入蔗糖并混勻后與高速冷凍離心機內于4 ℃，6 500 r/min，離心30 min，再經2層紗布過濾即得到大豆油體，并放置于4 ℃備用。

表1 滅酶處理條件

1.3.2 大豆油體提取前對大豆或豆漿的不同滅酶處理

1.3.3 大豆油體提取率計算[11]

大豆油體提取率=m2/m1×100%

(1)

式中：m2為提取的大豆油體總質量/g；m1為干大豆的質量/g。

1.3.4 大豆油體、豆渣及脫脂乳內基本成分含量的測定

為了考察大豆油體提取過程中整個提取工藝物料的流動情況，并且為豆渣和脫脂豆漿的回收提供數據，測定了大豆油體、豆渣、脫脂豆漿內的蛋白質、脂肪、含水量的變化[12-14]。

1.3.5 大豆油體粒徑、電位的測定

油體粒徑大小是油體聚合物乳液的重要性能，能表征乳液物理穩定性，直接影響到其相關產品的加工和應用。取得到的各種油體各5 g并加入45 mL、pH7.0, 10 mmol/L的磷酸緩沖溶液于高速分散機內制成乳化液，測試溫度為25 ℃。

1.3.6 大豆油體流變性質的測定

流變儀條件：錐形板與平臺之間的間隙1 mm。黏度掃描：使用PP35Ti錐板，剪切速率范圍為0.100 0～100.0 s-1。頻率掃描：使用C35 2°Ti L錐板，進行動態頻率掃描。頻率掃描范圍為0.100 0～20.0 Hz。

1.3.7 大豆油體及脫脂豆漿中蛋白組成分析

加熱處理對于內源蛋白和外源蛋白均有影響[15]，以未加熱處理條件下大豆油體、脫脂豆漿為對照，探究滅酶加熱處理之后油體中蛋白的變化。SDS-PAGE實驗參照Wang等[16]的方法，即分離膠12%、濃縮膠4%，上樣量20 μL，初始電流為20 mA，溴酚藍指示劑進入分離膠后，調整電流為40 mA。考馬斯亮藍染色2 h，脫色后于凝膠成像系統拍照。

1.3.8 大豆油體應用分析

1.3.8.1 不同pH條件下大豆油體的乳析穩定性、粒徑、電位的測定

取1.3.2步驟得到的大豆油體50 g并加入450 mL pH7.0，10 mmol/L的磷酸緩沖溶液于高速分散機內制成乳化液，然后取7等份量為50 mL的乳液，用0.1 mol/L的HCL和0.1 mol/L的NaOH調乳液pH為2、3、4、5、6、7、8。取10 mL放置于離心管放置24 h測量其乳析穩定性，乳析穩定性的結果利用乳化系數進行表示，計算方法見式(2)[17]。

(2)

式中：CI為乳化系數；He為靜置24 h后乳液層的高度；Ht為體系總體高度。

1.3.8.2 不同NaCl濃度下大豆油體乳析穩定性、粒徑、電位的測定

取1.3.2步驟得到的大豆油體5 g，用含NaCl濃度為0、10、25、50、100、150 mmol/L的pH7.0的10 mmol/L的磷酸緩沖液各45 mL配制成不同濃度的乳液，各取10 mL于離心管中，放置24 h測其乳析穩定性。

1.3.8.3 不同溫度下大豆油體乳析穩定性、粒徑、電位的測定

取1.3.2步驟得到的油體50 g，加入pH7.0的10 mmol/L的磷酸緩沖液450 mL配制成乳液，分裝于不同10 mL離心管中，于-20、4、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃條件下放置30 min后再放置24 h測其乳析穩定性。

2 結果與分析

2.1 不同滅酶熱處理條件下大豆油體的提取及性質分析

2.1.1 大豆油體提取率

從圖1中可以看出，高壓蒸汽滅酶熱處理條件下的提取率最高，分別為33.58%、37.57%、33.44%。豆漿滅酶熱處理方法的提取率次之，漲豆進行30 min熱處理的方法提取率最低。有研究表明短暫的加熱時間可以改變蛋白質的二級結構，導致部分變性，從而蛋白表面的疏水性增加，使得油體的外源蛋白附結在油體蛋白上，油體提取率會增加[18]。但這種油體具有極大的不穩定性，外源蛋白會隨著理化性質的變化而脫離油體使得油體在應用時有乳清析出特別明顯的狀況。未處理條件下得到的油體提取率與章書婷[19]對大豆在不加處理的情況下的回收率(24.58%)相差不大，豆漿滅酶處理提取率比較接近未處理，而對漲豆進行滅酶處理條件下大豆油體提取率較低，不適合工業化生產。

注：處理條件1～3分別表示高壓蒸汽(110±5)℃、10 s，高壓蒸汽(120±5)℃、10 s，高壓蒸汽(130±5)℃、10 s，處理條件4～9分別表示70 ℃浸泡漲豆 30 min，80 ℃浸泡漲豆 30 min，豆漿65 ℃、30 min，豆漿75 ℃、30 min，豆漿85 ℃、30 min和未處理。余同。圖1 不同滅酶熱處理條件下大豆油體的提取率

2.1.2 大豆、油體、豆渣及脫脂乳內基本成分含量對比

從表2中數據可知，大豆中蛋白質量與脂肪質量比約為1∶0.68，未處理油體中蛋白含量與脂肪含量比約為6.30∶1，這說明，未處理條件下得到的油體比較純，沒有其他的雜質。從已有研究提取的油體濕基中來看，一般脂肪質量分數在30%～40%，蛋白質量分數一般在5%左右[19,20]，這也符合純油體的組分特征，即脂質占整個油體質量的92%～98%，蛋白約占整個油體質量的1%～4%。而高壓蒸汽滅酶條件下的油體，蛋白與脂肪含量明顯不符合大多數人油體濕基組分特征，其蛋白含量相對脂肪含量較高，豆漿滅酶處理條件下得到的油體的基本成分含量比較接近未處理，且75 ℃、30 min條件下的油體最接近未處理，也符合大多數人油體濕基含量特征。

表2 各種油體及大豆成分含量對比

表3和表4可得知，大豆油體提取過程中的殘渣和脫脂豆漿具有回收價值，豆渣中還殘留有4%左右的蛋白和1.5%左右的脂肪，且除蛋白和脂肪外，其余的組分為和大豆中相同的多糖、纖維素等碳水化合物。脫脂乳中主要成分為水，還含有少量的蛋白和脂肪。從大豆油體提取的角度講，高壓蒸汽滅酶條件下豆渣中殘留的蛋白與脂肪含量較高，漲豆浸泡滅酶處理次之，未處理和豆漿滅酶處理條件下豆渣中殘留蛋白與脂肪含量最少。

表3 各種豆渣中成分含量對比

表4 脫脂乳中成分含量對比

圖2 不同滅酶條件下大豆油體粒徑的變化

2.1.3 大豆油體穩定性質分析

粒徑和電位是表征油體穩定性的兩個常用指標，由于油體表面蛋白殘基帶有負電荷，所以油體呈現為負電位，并且油體表面帶的負電荷越多，油體之間斥力越大，油體越穩定[21]。大豆油體的直徑一般為0.2～0.5 μm之間，粒徑較小，油體較純，油體表面沒有多余的外源蛋白，油體較穩定。圖2為不同滅酶條件下的油體的粒徑，高壓蒸汽滅酶條件下油體粒徑已經超出正常范圍，說明大豆油體提取不純，有較多的外源蛋白聚集在大豆油體的表面。浸泡漲豆滅酶條件下得到的大豆油體粒徑與豆漿滅酶條件下大豆油體粒徑相差不大，且豆漿滅酶條件下大豆油體粒徑更小也在正常范圍之內，大豆油體較純，75 ℃、30 min豆漿滅酶條件下，大豆油體粒徑最小。圖3所示為電位變化，未處理條件下得到的大豆油體電位絕對值最大，高壓蒸汽滅酶條件下油體電位絕對值隨著溫度升高而增大，這與粒徑的大小相符合，說明在熱處理時間短暫的條件下大豆油體的穩定性是隨著溫度增加而上升的，其他條件下大豆油體電位絕對值相差不大，但都處于穩定狀態下大豆油體電位值范圍之內，導致這樣的原因可能是大豆油體表面蛋白含量多，種類豐富，在鹽橋的作用下可以保持穩定[22]。

圖3 不同滅酶條件下大豆油體電位的變化

2.1.4 大豆油體流變性質分析

2.1.4.1 黏度掃描

如圖4所示，總體來看，在不同滅酶條件下得到的大豆油體樣品的黏度隨著剪切速率的增加而降低，均表現出剪切變稀的性質，假塑性流體最主要的特征就是黏度隨著剪切速率的增大而下降[23]，因此大豆油體屬于假塑性流體，可以將其直接應用到食品、藥品等領域。在接近于零的剪切速率下，不同條件下得到的大豆油體表現出不同的表觀黏度，其中高壓蒸汽滅酶條件下和浸泡漲豆滅酶條件下的大豆油體表觀黏度較大，多是由于油體表面外源蛋白與蛋白之間相互作用引起的。豆漿滅酶條件大豆油體測得的曲線擬合未處理曲線的效果比較好，且表現出較為合理的表觀黏度。

圖4 不同滅酶條件下油體、豆漿、浸泡漲豆黏度的變化

2.1.4.2 頻率掃描

如圖5所示，彈性模量均大于黏性模量，說明大豆油體中彈性成分占優勢，表現出弱凝膠的性質，在頻率掃描范圍內，其彈性模量和黏性模量均隨著頻率的增大而增大，其流變學特征依賴于頻率變化說明油體在動態過程中是一種黏彈性體系。未處理大豆油體的掃描頻率為0.159 2 Hz時的彈性模量和黏性模量值為353 Pa和78 Pa，與吳娜娜等[24]的研究大致相同，未處理條件下大豆油體在0.1～2.0 Hz的頻率掃描范圍內彈性模量和黏性模量的值增幅大于2～18 Hz頻率范圍內的，說明未處理條件下的大豆油體在低頻率時表現出液體性質，在高頻率時表現出半固體性質。由圖5可以看出只有豆漿滅酶條件下得到的大豆油體的初始模量值與未處理相差不大，浸泡漲豆滅酶次之，高壓蒸汽滅酶相差較大，一般來講，這種蛋白質-脂肪體系的彈性模量值和黏性模量值不能太大，太大產品表現出極度不穩定性，故而要想使產品保持穩定性，必須在保持黏、彈性模量值比例不變的情況下降低產品的黏、彈性模量值。

圖5 不同滅酶條件下大豆油體、豆漿、浸泡漲豆動態頻率掃描

2.2 最佳工藝條件下大豆油體蛋白組成分析及應用分析

2.2.1 大豆油體及脫脂豆漿中蛋白組成分析

電泳圖6顯示的是未處理條件下和豆漿經75 ℃、30 min加熱滅酶條件下大豆油體及脫脂豆漿中蛋白及蛋白亞基含量變化，通過電泳來表征油體表面蛋白的變化，從而表征大豆油體的穩定性。如圖6所示，未處理條件下得到的大豆油體，其內源蛋白有少量24 ku和17 ku的oleosin異構體，大量29 ku的caleosin、39 ku的sterolesinA和41 ku的sterolsinB，由于濃度太大或含量太高，這些分子質量相差不大的蛋白條帶聚集在了一起，導致條帶顏色較濃[22, 25]。外源蛋白有β-伴大豆球蛋白即7S、7S有α`、α、β這三個亞基，分子質量為71、67、50 ku，另外還有11S球蛋白包括酸性A肽鏈(37～42 ku)和堿性B肽鏈(17～20 ku)[26]。由圖6可知，未處理條件下提取的大豆油體均含有7S蛋白、11S蛋白，11S蛋白含量較多，但是經過75 ℃、30 min的豆漿滅酶之后，大豆油體的這些外源蛋白大部分被去除，只含有24 ku的oleosin蛋白，39 ku的sterolesinA和4 1 ku的sterolsinB內源蛋白和少量外源蛋白，說明經過滅酶處理后得到的大豆油體較純，雜蛋白較少。另外，脫脂豆漿中還含有大量的蛋白，但從其條帶來看，大部分為大豆油體外源蛋白，滅酶對其組分無影響。

圖6 電泳結果

2.2.2 不同pH條件下大豆油體的乳析穩定性、粒徑、電位結果分析

如圖7所示，乳化系數在pH2和pH3的條件下為零，pH5的條件下乳化系數最大，從乳化穩定性方面來說，酸性條件下大豆油體比較穩定，而pH5左右的乳液體系本來分散在水相的大豆油體發生了聚集，導致乳清析出，乳液表現為極不穩定。粒徑在酸性條件和堿性條件屬于油體正常范圍，而在pH5附近，大豆油體粒徑變大，不在大豆油體粒徑正常范圍，此時大豆油體發生聚集，粒度儀檢測的是多個大豆油體的聚集體，大豆油體不穩定。正符合油體所處pH小于7時，油體膜表面的油體蛋白中存在的組氨酸殘基會中和油體膜表面原存在的負電荷，致使油體表面蛋白的電位值降低，導致油體絮凝失穩[27]。且大豆油體電位在pH4～pH5之間的某一點為零，說明大豆油體的等電點在4～5之間[22]。乳析穩定性結果與粒徑和電位表征大豆油體乳液穩定性的結果相一致，說明大豆油體可用于酸性和堿性產品中。

圖7 不同pH條件下大豆油體乳化系數、平均粒徑、電位的變化

2.2.3 不同NaCl濃度下大豆油體乳析穩定性、粒徑、電位結果分析

如圖8所示，大豆油體的乳化系數隨著NaCl濃度的增大而變大，粒徑也NaCl濃度的增大而變大，電位絕對值隨著NaCl濃度的增大變小，這與何勝華等[7]的研究一致，隨著NaCl濃度的增大，鈉離子的加入中和了油體表面蛋白的負電荷，使得大豆油體表面帶電量減小，電位下降，大豆油體之間靜電斥力減小，大豆油體易于聚集，大豆油體粒徑變大，乳化系數增高。但是在低NaCl濃度條件下，大豆油體之間的不穩定性差距不明顯。因此大豆油體可用于低鹽條件下的產品。

圖8 不同NaCl濃度條件下大豆油體乳化系數、平均粒徑、電位的變化

2.2.4 不同溫度下大豆油體乳析穩定性、粒徑、電位結果分析

由圖9可知，除冷藏溫度外，大豆油體的乳化系數大致隨著溫度的增高而變低，溫度對粒徑沒有明顯的影響，電位除了冷存溫度外逐漸減小，熱處理導致油體表面蛋白分子結構發生變化，結構舒展，疏水性能增加，大豆油體乳液的乳化性能變好，可溶性較高，這與Li等[5]的研究大多一致。冷藏處理對大豆油體粒徑和電位無影響。

圖9 不同溫度條件下大豆油體乳化系數、平均粒徑、電位的變化

2.2.5 不同pH條件下大豆油體乳液流變性結果分析

pH對乳液穩定性的主要影響是改變了油體液滴表面的電荷，從而影響了其液滴間的靜電排斥作用，導致乳液會出現不穩定現象[28]。對豆漿滅酶條件下得到的大豆油體進行不同pH的處理，對其形成的不同pH的乳液進行穩態黏度掃描，結果如圖10所示。總體來看，乳液黏度隨著剪切速率的增加而減小，表現為剪切變稀，這與大豆油體表現為相同的性質，均為非牛頓流體中的假塑性流體。在pH2和pH3條件下的乳液在相同速率下的表觀黏度最小，且其剪切變稀現象不明顯。在接近于大豆油體PI的pH(4、5)條件下的大豆油體的表觀黏度最大，這是由于不同的pH條件改變了油體表面蛋白的帶電狀況，甚至結構，從而大豆油體蛋白之間更易發生交聯，相互作用，形成網狀結構。尤其是接近于大豆油體PI時，大豆油體蛋白分子之間聚集，所以黏度增大。

圖10 不同pH條件下大豆油體乳液黏度掃描

2.2.6 不同NaCl濃度條件下大豆油體乳液流變性結果分析

如圖11所示，大豆油體乳液表現出剪切變稀的性質，屬于非牛頓流體中的假塑性流體[29]，這與前面的研究相符合，隨著NaCl濃度的增加，大豆油體乳液體系的黏度也隨之增加，NaCl的加入使得大豆油體表面蛋白聚集，蛋白之間相互發生作用，容易形成網狀結構，形成凝膠，增大黏度。從而體現大豆油體界面表現出更強的固相性，其大豆油體乳液在液滴聚結方面更穩定[30]。

圖11 不同NaCl濃度條件下大豆油體乳液黏度掃描

2.2.7 不同溫度條件下大豆油體乳液流變性結果分析

在實際應用中，大豆油體會遇到溫度處理，在不同溫度處理下，大豆油體乳液均表現出剪切變稀的性質，屬于非牛頓流體中的假塑性流體[29]。結果顯示，除冷凍溫度外，隨著溫度的增加，大豆油體乳液的表觀黏度逐漸變小，這與稀奶油表現出相同的性質，在工業中，若要增加大豆油體及乳液的流動性，可以用適當升溫的方法。-20 ℃和4 ℃并不影響乳液的性質，因此可以應用其冷凍儲藏。

圖12 不同溫度條件下大豆油體乳液黏度掃描

3 結論

不同滅酶熱處理條件下大豆油體提取率不同，高壓蒸汽滅酶條件下大豆油體的提取率最高，為33%～37%，但大豆油體蛋白含量較高，極不穩定，不利于直接應用；豆漿滅酶條件下大豆油體提取率約為20%，此時大豆油體蛋白與脂肪含量接近于未處理條件下的油體，比較穩定，利于直接應用；浸泡漲豆條件下大豆油體提取率最低，約為15%，不利于工業化生產與實際應用。綜合評定，確定大豆油體的最佳工藝是豆漿75 ℃、 30 min的熱處理，在此條件下，大豆油體的外源蛋白大部分被去除，只余有24 ku的oleosin蛋白，39 ku的sterolesinA、41 ku的sterolsinB內源蛋白和少量外源蛋白，大豆油體較純，脫脂乳條帶無明顯變化，對回收具有意義。大豆油體、大豆油體乳液均屬于假塑性流體，可以直接用于食品、藥品等領域，也可用于酸、堿、低鹽條件下的產品中。若增加或減少其表觀黏度，或是在實際生產中確定使用某一黏度，可以根據不同條件下的流變學特性設置條件和參數。