大豆球蛋白G5A3亞基加工破壞表位的初步定位

王一超， 席 俊， 陳慧彬， 李英英， 段宇瑩， 孫富宇

(河南工業大學糧油食品學院，鄭州 450001)

隨著生活水平的不斷提高，人們對食品安全也更加重視，其中食物過敏現象頗受關注，大豆是主要食物過敏原之一，在全球過敏人口中大約有25%的患者對大豆過敏[1-3]。大豆過敏是由過敏原蛋白引起的異常的免疫反應，且其免疫原性與蛋白結構有一定關系[4,5]，研究表明當抗原分子高級結構的復雜度增加，其致敏性隨之增強，結構丟失和隱藏的表位也可能產生類似的影響[6]。因抗原的致敏性與其結構特征緊密關聯，所以當前食品工業中常用的過敏原脫敏方法有超高壓法，熱處理，化學法及酶解法[7-10]，同時，也有研究從遺傳育種角度，借助基因工程的方法從根本上解決植物蛋白的致敏性問題[11]。

大豆球蛋白是從大豆中獲取的被分隔儲存的蛋白質[12-14]，占11S組分的85%，所以又稱為11S球蛋白，是重要的致敏原，分子質量約為350 ku，每個大豆球蛋白有6個亞基，每個亞基由酸性肽鏈(35～37 ku)和堿性肽鏈(20 ku)通過二硫鍵連接而成[15]。抗原表位是蛋白質抗原性的依據，目前可以采用定位并破壞抗原表位的方法來降低大豆致敏性[16,17]，常用的抗原表位預測技術和抗原表位定位技術均采用信息學軟件進行分析，其中，T7噬菌體展示系統[18]能夠表達不同分子質量的蛋白質，穩定性高，復制周期短，能夠感染大腸桿菌并形成噬菌體斑塊[19]，利用噬菌體表達蛋白并進行純化，通過硫酸銨純化的抗體[20]鑒定表達蛋白的抗原表性。本研究團隊通過噬菌體表達蛋白和ELISA法確定β-conglycinin的α亞基抗原性最高的氨基酸序列，分別為380EGQ-SKR408、404ALS-EKN448[21]；皮江一[22]通過將外源基因與噬菌體載體連接，在噬菌體中表達外源蛋白質并通過鑒定，定位到β-conglycinin的β亞基的致敏性氨基酸序列為378DNV-AQD400。實驗室已成功預測大豆球蛋白G5亞基中酸性A3亞基的抗原表位，并成功將A3亞基的3個重疊分段的基因載體克隆完成并保存。

本實驗通過完成A3亞基全長的載體克隆，并通過T7噬菌體展示技術表達A3亞基及其3個片段的蛋白[23]，用間接競爭ELISA法檢測目的蛋白破壞抗原表位，為后續精確定位G5亞基中A3酸性肽鏈的致敏表位的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質粒提取試劑盒；DNA回收試劑盒；A3亞基以及3個重疊分段片段 A, B, C 的上下游引物；E. coli JM109 Competent Cells； pMDTM 18-T vector Cloning Kit；DNA Marker； Ribonuclease A；Recombinant DNase Ⅰ；T4 DNA Ligase；QuickCutTMEcoRⅠ；QuickCutTMHind Ⅲ；EX TaqTMVersion 2.0；噬菌體試劑盒。

1.2 儀器與設備

nexus GSX1 PCR儀，Tanon-2500凝膠成像系統，D3024R離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆球蛋白A3亞基氨基酸序列

通過NCBI數據庫檢索大豆球蛋白A3亞基的氨基酸序列：

ITSSKFNECQLNNLNALEPDHRVESEGGLIETWN- SQHPELQCAGVTVSKRTLNRNGLHLPSYSPYPQMIIV- VQGKGAIGFAFPGCPETFEKPQQQSSRRGSRSQQQLQ- DSHQKIRHFNEGDVLVIPPGVPYWTYNTGDEPVVAIS- LLDTSNFNNQLDQNPRVFYLAGNPDIEHPETMQQQQ- QQKSHGGRKQGQHQQQEEEGGSVLSGFSKHFLAQSF- NTNEDTAEKLRSPDDERKQIVTVEGGLSVISPKWQEQ- EDEDEDEDEEYEQTPSYPPRRPSHGKHEDDEDEDEE- EDQPRPDHPPQRPSRPEQQEPRGRGCQTRN。

1.3.2 大豆球蛋白A3亞基抗原表位的預測

采用DNAstar，SOPMA，DiscoTope 2.0等預測11S球蛋白G5亞基中酸性A3亞基的B細胞抗原表位。

1.3.3 A3亞基的重疊分段及引物設計

根據預測出的抗原表位，在不打斷抗原表位的情況下將A3亞基進行重疊式分段，每一段序列與前段序列重疊的氨基酸殘基數目為60個，使用Primer Premier 5軟件檢測模板中不含有 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ位點，設計引物結構為5′-保護堿基-酶切位點-引物序列-3′，上游引物的限制性內切酶為EcoR Ⅰ，下游的限制性內切酶為Hind Ⅲ。

1.3.4 A3亞基的PCR擴增及其克隆載體的構建

A3亞基的3段分段基因的載體構建以由實驗室完成并保存，現只需做全長基因的擴增及其克隆載體的構建。

1.3.4.1 A3亞基全長的基因擴增

根據大豆球蛋白A3亞基全長的堿基序列，用PCR擴增目的基因。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s,變性、退火和延伸這3個條件循環34次；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存，用2%的瓊脂糖電泳檢測PCR基因產物。

表1 PCR反應體系

1.3.4.2 A3基因的回收

用DNA回收試劑盒將基因收回并保存于-20 ℃備用，具體參照試劑盒的操作步驟。

1.3.4.3 連接與轉化

連接體系(10 μL)：pMDTM-18T 載體：1 μL，DNA：4 μL，Ligation buffer：5 μL，將此體系置于16 ℃恒溫箱連接過夜。

轉化：將10 μL連接產物與25 μL感受態細胞混勻，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，置于冰上冷卻5 min后加入500 μL SOC Medium混勻，于37 ℃震蕩培養1 h。將培養液在4 000 r/min下離心4 min，吸取 400 μL上清液棄之，將剩余溶液吹打混勻涂布于含Amp+(50 μg/mL)、IPTG(50 mg/mL)和X-gal(20 mg/mL)的固體培養基上，待凝固完全，在37 ℃培養箱倒置培養12～16 h，直至形成肉眼可見的藍白斑。

1.3.4.4 白斑鑒定與基因酶切

挑取固體培養基上的單個白斑，溶解于20 μL TE中，水浴鍋65 ℃加熱10 min離心取上清，PCR鑒定重組質粒，再挑去白斑接種于含25 μg/mL Amp+的LB液體培養基中，37 ℃震蕩培養10～12 h，7 000 r/min離心10 min取沉淀。用質粒小量提取試劑盒提取質粒(具體參照試劑盒操作步驟)，并進行雙酶切及PCR鑒定。

表2 PCR鑒定體系

PCR反映程序同1.3.4.1所述。

表3 雙酶切鑒定體系

將該體系在37 ℃水浴鍋中混勻50 min，用2%瓊脂糖凝膠進行分析并且用DNA回收試劑盒將基因收回并保存于-20 ℃備用。

1.3.5 噬菌體包裝及鑒定

1.3.5.1 噬菌體包裝

將回收純化后的基因與噬菌體 vector arms連接，體系見表4。

表4 噬菌體包裝體系

將此體系混勻之后置于16 ℃恒溫孵育12～16 h，然后在連接產物中加入5倍體積的T7包裝提取物并混勻，置于22 ℃恒溫孵育2 h，加入9倍體積的LB液體培養基終止反應。

1.3.5.2 重組噬菌體的滴度測定

將大腸桿菌BLT5615加入8 mL 含有Carb+和IPTG的M9LB液體培養基中，37 ℃震蕩培養至OD600=0.6～0.8。用LB培養基對重組噬菌體進行103、104、105倍的梯度稀釋，取不同稀釋度重組噬菌體100 μL與5 mL預熱的Top agarose和250 μL BLT5615混合均勻鋪在含Carb+的固體培養基上，靜置30 min，在37 ℃培養箱倒置培養4 h后觀察噬菌斑，計算噬菌斑滴度(PFV)。

式中：X為噬菌斑數目；Y為對應的噬菌體稀釋倍數。

1.3.5.3 重組噬菌體的PCR鑒定

挑選一個噬菌斑溶解于30 μL TE中[21]，65 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心1 min取上清，做PCR鑒定。

表5 PCR鑒定體系

重組噬菌體PCR體系：80 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，變性、退火和延伸這3個條件進行35個循環；再延伸6 min；4 ℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因片段。

1.3.6 重組噬菌體的擴大培養與保存

將BLT5615接種于8 mL含carb+的LB液體培養基，37 ℃培養過夜，將1 mL培養過夜的菌液加入46 mL含carb+和IPTG的M9LB中誘導培養至OD600=0.6～0.8，取10 μL的重組噬菌體接種于菌液中，37 ℃培養至菌液澄清為止，期間大約4 h，然后將噬菌體裂解物于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液以噬菌體：氯仿=15∶1的比例加入37 μL氯仿置于-80 ℃保存。

1.3.7 重組噬菌體的純化

室溫下向噬菌體的裂解物中加入固體PEG8000至終濃度為10%，以及終濃度為1 mol/L的NaCl，緩慢攪拌至溶解完全，冰浴1 h以上或者4 ℃過夜用以沉淀噬菌體顆粒，將冰浴后的溶液緩慢置于離心機，4 ℃，10 000 r/min離心10 min收集噬菌體顆粒。取500 μL無菌SM溶液重懸噬菌體顆粒，緩慢轉移至離心管，22 ℃孵育1 h后加入625 μL氯仿抽提懸濁液中殘留的細胞碎片和PEG8000，輕輕震蕩30 s后，4 ℃，5 000～6 000 r/min離心10 min分離水相，水相即為純化富集的噬菌體。

1.3.8 大豆球蛋白兔源多抗效價測定

經硫酸銨純化后的濃度為32.587 mg/mL的大豆球蛋白兔抗由實驗室姚利利制備[22]。

用CBS溶液將重組噬菌體蛋白溶液稀釋至50 μg/mL，包被于96孔的ELISA板，每孔加入100 μL，設置3組平行，同時設置陰性和空白對照(包被用CBS)，放置4 ℃過夜；方法參考文獻[21]。

1.3.9 加工破壞抗原表位特異性抗體的制備

參考文獻[22]中熱加工處理大豆球蛋白抗原最佳條件為蛋白濃度10 mg/mL、110 ℃、50 min；超高壓聯合熱加工處理[24]抗原最佳條件為10 mg/mL，先超高壓400 MPa加工15 min，然后130 ℃熱處理20 min，抗原抑制率由87%降至37%。

將處理后的抗原與經過400倍稀釋的兔抗分別加1 mL混勻，37 ℃孵育2 h之后，6 000 r/min離心1 min取上清，上清即為熱處理和超高壓聯合熱加工處理破壞抗原表位特異性抗體。

1.3.10 重組噬菌體的抗原性檢測

取用CBS溶液將噬菌體表達出來的蛋白溶液稀釋至50 μg/mL，然后包被96孔的ELISA板，每孔加入100 μL，同時設置陰性對照和空白對照(包被用CBS)，4 ℃過夜，拍板方法參考文獻[21]。

2 結果與討論

2.1 大豆球蛋白A3亞基的抗原表位預測

采用生物學信息軟件預測出A3亞基的主要線性表位區域為：90FEK-LQD109，169PDI171，174PETMQQ179，181QQQ-EEE200，230PDDERK235，249PKW251。

2.2 大豆球蛋白A3亞基的重疊分段(劃線部分為重疊片段)

第1段(1 ～ 140AA)：

ITSSKFNECQLNNLNALEPDHRVESEGGLIETWN- SQHPELQCAGVTVSKRTLNRNGLHLPSYSPYPQMIIVV- QGKGAIGFAFPGCPETFEKPQQQSSRRGSRSQQQLQD- SHQKIRHFNEGDVLVIPPGVPYWTYNTGDEP

第2段(81 ～230AA)：

保密性是無線通信網絡信息安全防護的主要方式。無線通信網絡系統的保密性業務主要包括語音與數據保密性、用戶身份與位置保密、用戶和網絡間信息保密性等。采用保密性方式之后，除了信息的參與者之外，其他人即使截獲了信息也不能破解其中的含義。

AFPGCPETFEKPQQQSSRRGSRSQQQLQDSHQKI- RHFNEGDVLVIPPGVPYWTYNTGDEPVVAISLLDTSN- FNNQLDQNPRVFYLAGNPDIEHPETMQQQQQQKSHG- GRKQGQHQQQEEEGGSVLSGFSKHFLAQSFNTNEDT- AEKLRSP

第3段(171 ～320AA)：

IEHPETMQQQQQQKSHGGRKQGQHQQQEEEGG- SVLSGFSKHFLAQSFNTNEDTAEKLRSPDDERKQIVTV- EGGLSVISPKWQEQEDEDEDEDEEYEQTPSYPPRRPS- HGKHEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRPSRPEQQEPRG- RGCQTRN

2.3 A3亞基分段引物的設計

大豆球蛋白A3亞基基因分段引物設計如表6所示。

表6 大豆球蛋白A3亞基基因分段引物

2.4 A3亞基的PCR擴增及其克隆載體的構建

2.4.1 A3亞基全長的基因擴增

以上海生工合成的載體質粒為模板，采用PCR技術得到A3基因，經2%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，觀察到的目的條帶與預期片段大小相符，且沒有非特異性擴增，說明引物的特異性好。

注：M為DNA Marker Ⅲ；A3為全長。余同。圖1 總長PCR擴增

2.4.2 重組質粒的PCR鑒定和酶切鑒定

構建基因克隆并成功的轉化到E.coli JM109 Competent Cells中，挑取白色菌落用TE加熱溶解并以此為模板進行PCR擴增，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示，觀察發現A3片段的長度與目的條帶相符，說明重組質粒構建成功。

圖2 重組質粒的PCR鑒定

將挑取的白色菌落進行擴大培養，提取質粒后進行雙酶切鑒定，結果如圖3所示，上方條帶為細菌的環狀質粒，經過酶切后，環狀質粒的長度與pMD18-vector 載體的長度相當且大于目的條帶，下方條帶大小為960 bp，與目的條帶大小相符，驗證了酶切成功。

圖3 重組質粒的酶切鑒定

2.5 噬菌體包裝與鑒定

2.5.1 噬菌斑滴度測定

A3全長及其分段基因經酶切后與T7 vertor arms進行連接，加入包裝提取物并轉入大腸桿菌BLT5615，4 h后形成噬菌斑，如圖4所示，通過計算得到A3基因及其A片段、B片段、C片段的重組噬菌體滴度分別為：6×106、1×106、5×105、1×105pfu。

圖4 重組噬菌體噬菌斑

2.5.2 重組噬菌體的PCR鑒定

挑選噬菌斑用TE溶解，65 ℃加熱10 min，進行PCR擴增，用2%瓊脂糖電泳得到的結果如圖5所示，電泳條帶與目的條帶大小相一致。

注：1～3分別為片段A、片段B、片段C。圖5 重組噬菌體的PCR鑒定

2.6 加工破壞抗原表位的抗原性檢測

2.6.1 大豆球蛋白兔抗效價的測定

不同稀釋倍數的抗體與抗原反應的吸光度值如圖6所示，隨著稀釋倍數的增加，OD450值逐漸降低，A3亞基的3個片段抗原性最高的是片段1、片段2和片段3的抗原性相差不大。

注：a-h為:差異性分析。圖6 大豆球蛋白兔抗效價測定

OD450值為1～1.5時，抗體能跟抗原有效結合，因此在1～1.5區間內取抗體的最佳稀釋倍數，如果OD450>2或者OD450<1時，會超出抗原抗體的線性結合范圍，導致測得的數據不準確，影響實驗結果，而且低稀釋倍數在制作熱吸收抗體時需添加濃度過高的大豆球蛋白，蛋白會過多聚集形成網狀膜，使得抗原抗體不能完全反映，影響熱吸收抗體與目的蛋白結合。因此，兔抗經過800倍稀釋時的效果最好。

2.6.2 加工破壞抗原區域的ELISA鑒定

間接競爭ELISA結果如圖7所示，片段1的抗原性最高，片段2和片段3的抗原性相差不大，片段上的表位越多就會結合更多的抗體，結果顯示的抗原性就高。從加工方式來看，不同的加工方法對蛋白的破壞程度也有一定差異，加工破壞的程度高，則抗體與破壞后的蛋白結合的表位變少，熱吸收抗體會與包被的目的蛋白上的表位結合，HRP會標記結合目的蛋白的抗體，并與TMB發生顯色反映，結果顯示OD450值越高，抗原性就越強，反之則低。圖7顯示，超高壓聯合熱處理的方法對蛋白的破壞程度顯著，其中對片段1的破壞最強，說明此處理方法使大豆球蛋白二級結構中的α-螺旋和β-折疊的含量降低，使得抗原表位減少；熱處理單獨作用的效果不顯著，蛋白本身的熱穩定性高，而且在熱處理過程中，改變了蛋白質的空間結構，在破壞抗原表位的同時，會造成新的無規則卷曲，有可能出現新的抗原位點。因此，片段1的抗原性最強，且超高壓聯合熱處理的方法對于片段1的破壞效果最顯著，下一步主要研究對于片段一的分段表達及被破壞抗原區域定位。

注：字母表示差異顯著。圖7 間接競爭ELISA結果

3 結論

本實驗結果顯示，抗體與片段1結合最多，其抗原性最高，從加工破壞方式來看，超高壓聯合熱處理的方法對蛋白的破壞顯著性高，大大降低了蛋白中的致敏位點，而熱處理單獨作用的效果不顯著，可能是因為在加熱過程中沒有破壞掉隱蔽的位點或者又形成了新的無規則卷曲，2種方法都對片段1的破壞最強。

本研究通過成功構建表達載體并定位加工破壞最顯著的抗原片段，實驗中用到的載體試劑盒和噬菌體試劑盒的連接轉化效率高，操作簡便，能有效表達出目的蛋白，后續可進一步研究精確定位抗原表位，探究大豆球蛋白致敏性的分子機理等。