不同稻米基質發酵叢毛紅曲菌MS-1代謝產物分析

劉 姣, 李妍依, 王 婧, 丁 華, 張 珣, 周有祥, 楊 潔

(湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所1，武漢 430064) (農產品營養品質與安全湖北省重點實驗室2，武漢 430064)

紅曲菌(Monascusspp.)是我國傳統發酵食品的重要生產菌株，廣泛應用于香腸、腐乳、紅曲酒、紅曲醋和肉制品的加工[1]。自1984年首個紅曲菌被發現并命名以來[2]，目前已有至少19種紅曲菌被發現并保藏[3, 4]，主要包括叢毛紅曲菌(M.pilosus)、紫色紅曲菌(M.purpureus)和紅色紅曲菌(M.ruber)等[5]。紅曲菌可產生紅曲色素(Monascuspigments, MPs)、莫納可林 K(Monacolin K, MK)、γ-氨基丁酸等多種具有抗氧化、降血脂等功能的次級代謝產物，在食品著色劑、發酵劑和替代藥物等領域應用前景廣闊[6]。

紅曲，又稱紅曲米(Red kojic rice)、丹曲，是紅曲菌經過大米等淀粉原料發酵而成的傳統的藥食同源生物制品[7]。數據表明我國紅曲產品年產量近萬噸，相關產業產值達千億元[8]。然而，部分紅曲菌還可產生一種腎毒性真菌毒素——桔霉素(Citrinin，CIT)，限制了紅曲產品的應用[9]。選用不產或低產CIT的紅曲菌菌株進行紅曲產品研發和功能成分挖掘是促進紅曲產業發展的重要手段[10, 11]。因此，不產CIT且不具有CIT合成相關基因的叢毛紅曲菌(M.pilosus) MS-1被廣泛用于紅曲米發酵[12, 13]。發酵基質對紅曲菌代謝產物的產生具有重要影響[14, 15]。秈稻因其米飯具有疏松、黏性低、通氣性好、易于操作等優點，一直是生產紅曲米的重要原料[16, 17]。我國稻米資源豐富，占世界水稻資源的19.05%，也是世界上最大的水稻生產和消費國[18]。然而我國稻谷主要用于口糧，加工產品消費比例較低，稻谷資源合理化開發和高附加值利用問題日益突出[19]。

本研究將叢毛紅曲菌(M.pilosus) MS-接種于不同秈稻米培養基中制作紅曲米，分析比較紅曲米中主要次級代謝產物含量差異，探究不同稻米基質品質差異對叢毛紅曲菌MS-1代謝產物的影響，以期為安全高效紅曲產品的開發和秈稻的高附加值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

叢毛紅曲菌(M.pilosus) MS-1為本實驗室保藏。

1.1.2 試劑與培養基

甲醇、無水乙醇、鹽酸 (36%)、氫氧化鈉，均為分析純；甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純；Monacolin K標準品 (C24H36O5，CAS號75330-75-5，純度98%)。

土豆葡萄糖培養基 (Potatodextrose agar medium, PDA)：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，添加蒸餾水至1 L，用于活化紅曲菌株。

米飯培養基：將大米浸泡3 h后晾干，稱取15 g分裝于100 mL三角瓶中用于紅曲米的制備。所用6個品種為華占-Ⅰ、華占-Ⅲ、P7-1、HN19BX5、民豐B、5210S，對應編號為R1、R2、R3、R4、R5、R6。發酵后紅曲米對應編號為MR1、MR2、MR3、MR4、MR5、MR6。所用培養基均于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

8200全自動凱氏定氮儀，Fiastar 5000流動注射分析儀，ACQUITY HPLC液相色譜儀，ACQUITY UPLC高效液相色譜儀，7890A/5975C氣相色譜質譜聯用儀，U3900紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 大米品質分析

參照標準NY/T 83—2017[20]、NY/T 593—2021[21]和GB 5009.5—2016[22]中描述的分析方法，分別測定6個品種稻米(R1～R6) 的出糙率、精米率、粒長、堊白粒率、膠稠度、含水量、直鏈淀粉含量及蛋白質含量。

1.3.2 Monacolin K標準曲線的制備

內酯型Monacolin K (MKL)：稱取2.0 mg MK標準品，用75%乙醇溶液溶解并定容至10 mL，得到濃度為200 μg/mL的MKL標準溶液。

酸型Monacolin K (MKA)：稱取2.0 mg MKL 標準品，用0.2 mol/L的NaOH溶液(75%乙醇溶液配制)溶解并定容至10 mL，50 ℃超聲1 h后于室溫靜置1 h，得到濃度為200 μg/mL的MKA標準溶液。

標準曲線的制備：配制2、20、40、80、100 μg/mL梯度質量濃度的MKL及MKA標準工作液，經HPLC分析，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

1.3.3 紅曲米的制備

將叢毛紅曲菌MS-1接種于PDA斜面，28 ℃培養10 d，以 5 mL 無菌水洗滌活化菌株制備孢子懸液，經3層擦鏡紙過濾去除菌絲，于顯微鏡下計數，并將孢子液稀釋至 106個/mL。接種2 mL孢子液于米飯培養基中，28 ℃培養15 d后于45 ℃烘干，粉碎后裝入密閉袋，避光冷藏備用。

1.3.4 紅曲菌發酵產物分析

MPs分析：稱取0.05 g紅曲米粉于2 mL離心管中，加入1.5 mL甲醇溶液(80∶20)，高速渦旋1 min后，室溫超聲提取15 min，以12 000 r/min離心5 min，取出上清液，用紫外分光光度計分別于380、470、520 nm波長下測定紅曲黃色素、橙色素和紅色素色價。

MK分析：稱取0.1 g樣品于2 mL離心管中，加入1 mL乙醇溶液(75∶25)，高速渦旋1 min后，室溫超聲提取30 min，以12 000 r/min離心5 min，取出上清液，過 0.22 μm有機濾膜，濾液用于HPLC分析。HPLC分析條件列出如下：

色譜柱：TSKgel ODS-80Tm C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：238 nm；洗脫程序：0.1%甲酸水∶乙腈∶純水(3∶ 60∶37) 等度洗脫20 min。

風味物質分析：稱取1 g紅曲米粉于20 mL頂空進樣瓶中，加入2.5 g NaCl及5 mL蒸餾水，60 ℃條件下攪拌平衡15 min后用Supelco 50/30 um DVB萃取頭萃取10 min，然后將萃取頭插入氣質聯用儀進樣口解吸7 min。按下述質譜條件進行分析，色譜柱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2.0 min，再以5 ℃/min升至120 ℃，保持時間3 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。頂空色譜條件：取樣針120 ℃，載氣15 psi，傳輸線150 ℃，恒溫60 ℃，捕集阱Hi280 ℃，Lo 40 ℃；干吹5 min，捕集阱保持5 min，解析1.6 min。測得風味物質質量分數按式(1)計算：

(1)

式中：X為風味物質質量分數/%；AX為紅曲米中測得的風味物質X的峰面積；A0為稻米中測得的風味物質X的峰面積；AS為紅曲米中測得的所有物質峰面積之和。

1.3.5 數據分析

所有實驗均重復測定 3 次，結果表示為平均值±標準偏差。使用SPSS 16.0 進行Duncan’s多重比較和相關性分析，所得數據經Z-score標準化后使用SIMCA 13.0 進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 稻米品質比較分析

高淀粉含量和蛋白質豐富的發酵基質有利于紅曲菌次級代謝產物的合成[23, 24]，探究稻米品質不同造成的發酵基質差異對紅曲菌發酵產物的影響，對6個品種稻米的出糙率、精米率、粒長、堊白粒率等外觀品質和膠稠度、直鏈淀粉、蛋白質等理化性質進行了分析。由表1可知，6種稻米出糙率、精米率、粒長和水分含量相近，但堊白粒率、膠稠度、直鏈淀粉及蛋白質含量差別較大，變異系數均超過10%，說明6種稻米發酵基質差異顯著。

表1 稻米品質分析

2.2 紅曲米中代謝產物及風味物質分析

2.2.1 內脂式及酸式Monacolin K標準曲線的分析

將不同梯度質量濃度MKL及MKA標準工作液分別進行色譜分析，以峰面積為縱坐標(y)，MKL/MKA濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線。結果表明在0～100 μg/mL范圍內，MKL及MKA的線性回歸方程分別為y=24 837x-2 211.9和y=33 792x-6 913.1，相關系數R2分別為1和0.999 9，線性良好。

2.2.2 紅曲米中MK及MPs含量分析

利用HPLC分析6種稻米基質發酵叢毛紅曲菌MS-1所得紅曲米中MKL及MKA含量及紅曲黃色素、橙色素、紅色素色價(圖1)。由圖1a可知，所得6種紅曲米中MKA含量普遍高于MKL，圖1b表明各樣品中橙色素含量均低于黃色素和紅色素。紅曲米MR1中MKL和MKA的含量最高，紅曲米MR5中MPs含量最高但MK含量相對較低。結果表明同種發酵基質發酵紅曲菌，不同次級代謝產物含量變化趨勢并不完全一致，這與前人研究結果一致[24, 25]。雖然高淀粉含量發酵基質有助于紅曲菌次級代謝產物的產生，但MR4和MR6并未表現出較強的產MK和MPs的能力，原因還有待進一步分析。

注：同種產物中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同紅曲米中MK及MPs含量分析

2.2.3 紅曲米中風味物質種類分析

將6個紅曲米樣品進行頂空固相微萃取后分析紅曲米中風味物質。由表2可知，不同紅曲米中風味物質種類和質量分數差異較大，所有紅曲米樣品中共檢出14種風味物質，可分為酮類、醛類和酯類等多個類別，這與前人研究結果相似[26]。其中紅曲米MR3中風味物質種類最多，共檢出8種風味物質，主要成分為2-庚酮。紅曲米MR6中僅檢出1個風味物質，為棕櫚酸甲酯。紅曲菌在代謝過程中可產生多種酶類，因此廣泛應用于傳統發酵食品的釀造[27]。本研究初步分析了不同稻米基質發酵紅曲米中的風味物質差異，后續進一步研究其代謝變化規律，可為探究紅曲菌在釀造過程中的作用機制和貢獻程度提供參考。

表2 不同紅曲米中的風味物質分析

2.3 稻米基質對叢毛紅曲菌MS-1代謝產物的影響分析

2.3.1 相關性分析

為探究不同稻米基質對叢毛紅曲菌MS-1次級代謝產物的影響，進一步分析了稻米營養品質與叢毛紅曲菌MS-1發酵產物的相關性。由表3可知，樣品中MK含量與稻米各品質參數間相關性均不顯著且相關系數較低。MPs含量與堊白粒率的相關性不顯著但相關系數較高，說明大米堊白粒率可能影響MPs的合成。稻米堊白是由于稻谷灌漿不充分，導致胚乳中淀粉顆粒排列疏松、顆粒間存在間隙、淀粉顆粒排列不緊密造成的不透明部分[28]。從稻米基質本身淀粉結構及排列形式差異對紅曲菌發酵產物的影響目前還鮮有研究，進一步分析不同堊白粒率稻米結構特性差異，有助于揭示稻米基質結構與紅曲菌代謝產物的關系。此外，堊白是衡量稻米品質的重要性狀[29]，堊白粒率偏高是我國稻米品質提升的主要限制因素之一。因此，以堊白粒率較高大米為紅曲菌發酵基質，可為提高紅曲菌代謝產物含量和增加低品質稻米附加值提供新思路。

表3 稻米品質與紅曲米代謝產物的相關性分析

2.3.2 主成分分析

依據紅曲米主要代謝產物含量及稻米基質品質參數為變量進行主成分分析。圖2顯示2個主成分累積方差貢獻值達75.8%，可以反映6種紅曲米的主要特征。由圖2a可知，位于第4象限的紅曲米MR5在第一主成分上得分最高，與圖2b對應，MPs和壬醛也在第四象限呈聚集性分布，既說明了MPs和壬醛間的相關性，也說明MR5中MPs含量顯著高于其他紅曲米。位于第1象限的MR1在第2主成分上得分最高，對應載荷值較高的是MKA，表明MR1中MKA含量較高，同時也揭示了MKA和稻米膠稠度間的相關性。此外，載荷圖還顯示MPs、MKL、2-庚酮及壬醛含量均與稻米堊白粒率呈正相關。紅曲米MR2、MR3、MR4和MR6聚集在一起，且距離MR1和MR5較遠，說明這4個紅曲米成分較為接近。

圖2 主成分分析得分圖(a)和載荷圖(b)

主成分分析結果顯示6種紅曲米的主要代謝產物雖有明顯差異，但與稻米直鏈淀粉和蛋白質含量并無直接相關性，這與前人研究結果相似[16]?？梢?，稻米基質本身蛋白質、直鏈淀粉等理化性質的含量差異可能不是影響紅曲菌發酵的主要因素。前人研究表明，以碎米為發酵基質時MPs產量較高[25]，堊白對米飯斷裂程度有顯著影響，堊白度越高的稻米在蒸煮過程中越容易斷裂。

3 結論

不同稻米基質發酵所得紅曲米中代謝產物含量差異顯著。紅曲米MR1中MK含量最高約為340 μg/kg；紅曲米MR5中MPs含量最高，紅曲紅、橙、黃色素色價均高于40 U/g；所試6種紅曲米樣品中共檢出14種風味物質，紅曲米MR3中風味物質種類最多。相關性分析及主成分分析結果顯示稻米堊白粒率與紅曲米主要代謝產物含量正相關但不顯著。后續進一步分析不同堊白粒率稻米發酵過程中米粒斷裂或蓬松程度、孔隙度和孔隙排列等結構特性有助于揭示稻米基質結構與紅曲菌代謝產物的關系。