AFB1污染花生油激光誘導熒光信號受溫度干擾規律及溫度全局模型研究

何學明, 陳 敏, 楊小云, 張曼曼, 沈 飛, 袁 建, 胡秋輝, Firew Tafesse Mamo

(南京財經大學食品科學與工程學院;江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

花生油在日常生活與食品生產中發揮著重要作用，2020年，我國花生油總生產量達到320萬t，位居世界第一。然而作為一種季節性較強的農作物，花生在收獲前，當受到干旱和蟲害的威脅時，易被黃曲霉感染，收獲后，盛夏季節高溫多雨，空氣中水分含量較大，受溫濕度和儲藏方式等諸多因素影響，也極容易發生霉變[1]。對于已經發霉、破損的花生原料在儲藏期間都會增加霉變的概率，在儲藏過程中產生的真菌毒素會迅速擴散污染更多的作物[2]。花生油中的真菌毒素超標原因主要有：原料污染帶入、加工過程污染、儲存運輸不當、精煉工藝不當等[3]。花生油中污染的主要是黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1) 及黃曲霉毒素G2(AFG2)4種。黃曲霉毒素難溶于水、乙烷和乙醚，但易溶于甲醇、氯仿和乙腈等有機溶劑中，熔點為200～300 ℃，熱穩定好，耐高溫[4, 5]；黃曲霉毒素在弱酸環境中相對比較穩定，但在強酸強堿中會發生降解，喪失熒光性[6]。研究表明AFB1是所有黃曲霉毒素中毒性最強，且是花生油中含量最多的一種，約為黃曲霉毒素總量的65%～80%[7]。AFB1是目前發現的致癌力最強的天然物質(約為氰化物的10倍，砒霜的68倍)，1993年世界衛生組織國際癌癥研究機構將AFB1定為I類致癌物質[8, 9]。它主要是對人及動物肝臟組織具有強烈致癌、致畸和致突變等破壞作用。黃曲霉毒素危害人體健康主要是通過食用被黃曲霉毒素污染的食物，即使是痕量級水平的毒素長時間攝入可造成慢性中毒引起纖維病變[10]。我國2017年頒布的《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017) 規定花生油中AFB1限量指標為20 μg/kg[11]，美國食品與藥物管理局同樣規定花生油中黃曲霉毒素總量不得高于20 μg/kg[12]。

目前用于AFB1的檢測方法主要有：生物鑒定法、化學分析法、免疫分析法與儀器分析法。其中生物鑒定法需要飼養動物進行實驗，實驗周期長，不可控因素多，靈敏性和專一性較低。化學分析法常用的是薄層色譜法(TLC)，該方法的原理是：在紫外波長365 nm的照射下，AFB1將產生藍紫色的熒光，根據薄層板上所顯示熒光的最低檢測量來確定黃曲霉素的含量。雖然該方法成熟較早但檢測精度低，在實驗過程中的揮發物質對實驗人員與環境造成危害，樣本前處理繁瑣，因此難以在實際中應用。免疫分析法包括酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫熒光標記技術、免疫親和柱法(IAC)和免疫膠體金技術(ICS)等。其中ELISA法在植物油中有相關研究[13]，該方法具有靈敏、操作簡單、處理量大、不需要專用的大型設備、對操作人員要求也不高、成本也相對較低的優點，但是由于酶生產技術有限，且對保藏要求高，因此酶的不確定性使該方法經常出現假陽、陰性結果，除此之外，樣品提取程度和樣品基質對抗原抗體反應的影響也會導致在實際樣品的定量分析過程中常會發生測定值偏差的現象。目前被普遍采用的儀器分析法有高效液相色譜、氣相色譜法(GC)和液相色譜質譜聯用法(LC-MS)，這些傳統儀器分析技術可以實現高精度AFB1的檢測，但儀器昂貴，樣本需要前處理，操作復雜，檢測速度較慢，檢測成本高。

近些年來，為了能夠檢測到農產品中微弱的黃曲霉毒素信號，將傳統熒光法中的光源替換成了激光，并引入化學計量學方法分析光譜數據中隱藏信息，該方法即為激光誘導熒光光譜法(LIF)。LIF技術檢測AFB1的原理是根據AFB1在紫外光激發下(340～400 nm)會發出藍色(450 nm)熒光，該方法使用激光作為激發光源，提高了檢測靈敏度，且該技術在對污染樣本判別時所依據的是AFB1的特征熒光峰，是一種直接測量方法。現已有大量文獻報道將LIF技術應用于檢測受AFB1污染的花生[14]、 榛子[15]、開心果[16]等。結果顯示，檢測花生中AFB1時，其相關系數可達到0.99，區分AFB1污染和未污染榛子的正確率為92.3%，開心果中AFB1的檢測結果與HPLC檢測一致。Rasch等[17]利用LIF技術在葡萄酒生產過程中定性和定量測定真菌毒素污染情況，結果表明對于受AFB1污染的不同品種酒，其熒光光譜形狀是存在一定差異的。

激光誘導熒光光譜技術易受溫度等環境因素的影響。其中溫度的影響對熒光光譜檢測產生影響的因素非常多，當被檢測樣品確定時，環境溫度對檢測的影響較大。通常，溶液中分子運動加劇，就會有更多的熒光分子與溶劑發生碰撞，發生熒光猝滅，從而降低熒光強度[18]。目前研究證明大多數物質的熒光強度是隨溫度的升高而降低。梁穎等[19]研究了溫度對三角褐指藻葉綠素熒光特性的影響，結果發現溫度對熒光參數有顯著影響且溫度高的實驗組具有較低的熒光強度。易黎麗等[20]研究發現煉油廠中石油類污染物的熒光峰光譜的輪廓形狀和熒光峰的位置不隨檢測溫度的變化而改變，但熒光強度隨著溫度的升高而降低，從而提出對含油污水中油的種類及含量檢測時的溫度校正補償。因此，在進行常規熒光技術檢測時，若把這種溫度變化對建立的模型影響降低，常用的方法是建立數學模型時，將溫度變化因素考慮進去。即通過建立模型時加入實際應用中所涉及到的溫度范圍數據，降低溫度波動對預測模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗共購買10個品牌花生油，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定樣品中AFB1的含量(GB/T 5009.22—2016)，經測量均未檢出AFB1。各品牌花生油生產地點、生產方式與等級匯總在表1中。

表1 10個品牌花生油生產地點、生產方式與等級

稱取黃曲霉毒素B1標準品(純度≥98%)1 mg于100 mL容量瓶中用乙腈(色譜純)溶解并定容配制成黃曲霉毒素B1標準液母液 (10 000 μg/kg)，母液存于-18 ℃冰箱中備用。加入18、36、72、90、108 μL的10 000 μg/kg的AFB1溶液，配制污染AFB1為5、10、20、25、30 μg/kg的花生油，作為污染樣本組。加入108 μL的乙腈到花生油中，配置AFB1濃度為0的植物油樣本，純花生油作為控制組。每個污染濃度與對照組各10個樣本，每種花生油在每個溫度的樣本數為70。

使用恒溫水浴鍋(HH-6)與冰箱將花生油溫度分別控制在10、20、30、40、50 ℃，通過溫度計(TA601)測量溫度。每個品牌植物油共準備350份，共3 500個樣本。

1.2 激光誘導熒光光譜系統

本研究中使用的激光誘導熒光光譜系統示意圖如圖1所示。該系統主要包括激光器(MW-GX-375, 長春鐳仕)用于發射波長為375 nm的激發光，激光器通過UPS穩壓電源(C1K)供電。直徑為1 000 μm的照明光纖(P1000-2-VIS-NIR)用與連接激光器與準直鏡(COL-20K)，投射出準直激發光，垂直入射到植物油樣本表面。植物油樣本用比色皿(24 mm×24 mm×42 mm)裝盛，比色皿放置在升降臺上。植物油受激光激發后發射出的熒光通過濾光片(LPF400)與準直鏡(74-UV-02)，以過濾掉強度較大的發射光及雜散光，通過接收光纖與光譜儀(QE-Pro)以獲取210～980 nm波長的光譜信號。

圖1 激光誘導熒光光譜系統示意圖

熒光光譜通過OceanView軟件采集得到，積分時間設置為1 000 ms，平滑與平均次數均為2。每個樣本采集3次光譜，平均后的光譜為樣本實際光譜。

1.3 多元統計分析

主成分分析法(PCA)，作為一種無監督學習方法，被用于對未超標(<20 μg/kg)與超標(≥20 μg/kg)花生油的聚類趨勢分析[21]。采用Kennard-Stone算法，將每個溫度下的植物油樣本的數據分別按 3∶1的比例隨機分成校正集和驗證集[22]。分別使用線性判別分析(LDA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)與不同核函數(Linear, Polynomial, RBF)的支持向量機(SVM)對未超標與超標花生油進行判別分析，通過總分類正確率(CCR)、假陽性率(FPR)與假陰性率(FNR)對各模型效果進行評價，探索適用于植物油AFB1判別的最優建模算法。CCR表示正確預測的樣本總數的百分比。假陰性是指AFB1超標樣本被誤判為未超標樣本，由于AFB1對人體危害極大，因此假陰性樣本更應該避免。因此，好的模型應具有較低的FPR、FNR(尤其是FNR)和較高的CCR[23]。PCA在Unscrambler X (Version 10.4)軟件中進行，樣本分組、LDA、PLS-DA與SVM算法建模在Matlab (2019a)軟件中處理。

為了體現溫度對AFB1預測模型的影響，對分溫度模型與全局模型的預測效果進行比較。分別使用10、20、30、40、50 ℃下的校正集樣本進行建模，共建立5個AFB1判別模型，然后根據每個溫度下的校正模型對本溫度及其他4個溫度下的驗證集進行預測，分析分溫度模型對本溫度與其他溫度下驗證集的預測效果，并與全局模型進行比較。

2 結果與分析

2.1 光譜分析

LIF技術檢測AFB1的原理是根據AFB1在紫外光激發下(340～400 nm)會發出藍色(450 nm)熒光，而G族黃曲霉毒素發綠色熒光[24]。從圖2可知，在不同溫度下，花生油在400～600 nm波段范圍內的熒光強度隨AFB1含量的增長均呈上升趨勢。表明在溫度恒定的情況下，花生油的熒光強度與AFB1有較強線性關系。隨著溫度的升高，光譜輪廓形狀無明顯變化，但熒光強度隨著溫度的升高會出現不同幅度降低，基本滿足線性變化。樣本溫度變化不是太大，因此引起熒光強度的降低不是花生油樣本熒光基團發生變化導致的，可能是由于溫度升高，導致花生油的黏度降低，會發生熒光猝滅現象[25]。可以確定樣品溫度會對熒光強度產生影響，從而影響模型預測效果。為把這種溫度變化對建立的模型影響降低，常用的方法是建立數學模型時，將溫度變化因素考慮進去。即通過建立模型時加入實際應用中所涉及到的溫度范圍數據，降低溫度波動對預測模型的影響。

圖2 品牌1花生油在不同溫度下的平均熒光光譜

2.2 PCA結果

采用PCA對單個溫度及不同溫度花生油污染AFB1的熒光光譜數據結構進行了聚類分析。圖3是樣本PCA得分圖，無論單一溫度還是將5個溫度混合后花生油的AFB1未超標樣本和超標樣本之間分離趨勢均不明顯，原因是本研究中所檢測的花生油樣本有10個品牌，不同品牌間花生油樣本相關品質有區別，對AFB1熒光信號有一定的干擾，通過PCA得分圖難以將正常樣本與AFB1超標樣本精確區分。后續采取不同定性建模方法對正常與AFB1超標樣本進行判別。

圖3 樣本PC得分圖

2.3 判別結果

2.3.1 全局模型

基于10、20、30、40、50 ℃，5個溫度下的校正集樣本建立判別模型，對5個溫度下的驗證集樣本進行預測，使用不同建模方法(LDA、PLS-DA、SVM(Linear)、SVM(Polynomial)與SVM(RBF))對未超標與超標花生油進行判別分析，400～600 nm范圍內的熒光強度光譜作為模型自變量，通過總分類正確率(CCR)、假陽性率(FPR)與假陰性率(FNR)對各模型效果進行評價，不同模型預測結果如表2所示。不同模型校正集和驗證集預測效果有較大差別，其中SVM(RBF)預測效果最好，校正集CCR高達100%，FPR與FNR均為0，驗證集CCR高達99.66%，FPR為0.60%，FNR為0。LDA與PLS-DA模型效果較優，CCR可以達到80%左右，驗證集FNR為27%左右。SVM(Linear)與SVM(Polynomial)效果較差，CCR低于80%，驗證集FNR超過33%。由SVM(RBF)建立的溫度全局模型能夠極準確地對各溫度下的正常與AFB1超標花生油樣本進行判別，相對于其他模型，其CCR提高了超過18%，驗證集FNR提高了超過25%。表明徑向基函數(RBF)作為一種可以解決非線性的映射問題的函數，可以有效對不同品牌、不同溫度下花生油樣本的正常與AFB1超標樣本進行判別。在模型校正過程中，通過交叉驗證，確定核函數最優參數組合為：Kernel參數=0.2，C懲罰參數=1，Support Vectors=1 721。

表2 不同建模方法全局模型效果

2.3.2 單溫度模型

為了體現溫度對AFB1預測模型的影響，并根據全局模型結果中SVM(RBF)效果最優，通過SVM(RBF)并基于各溫度下的校正集樣本建立判別模型。使用各分溫度判別模型對本溫度與其他4個溫度下的驗證集樣本進行AFB1預測，預測結果如表3所示。

表3 不同溫度下SVM(RBF)分溫度判別模型預測AFB1效果

可以發現各分溫度模型，對于預測本溫度驗證集效果極優，但是對于其他4個溫度下的驗證集預測效果極差。如10 ℃模型預測10 ℃驗證集樣本，正確率高達98.86%，FPR低至0，FNR低至2.67%，當該模型預測其他4個溫度驗證集樣本時，CCR只有57%左右或者42%左右，且對于20 ℃與30 ℃驗證集，其FNR超過98%，表明驗證集樣本中超標樣本絕大部分被誤判成正常樣本，對于40 ℃與50 ℃驗證集，其FPR為100%，表明正常樣本全部被誤判成超標樣本。其他溫度分溫度模型預測結果也類似，但對于不同溫度其FNR與FPR的規律不相同。可以得出結論，當使用LIF技術對花生油樣本AFB1含量進行判別時，需要控制花生油溫度一致，否則將會出現極大誤差。若檢測時，不能達到控制樣品溫度的條件，可以建立不同溫度的全局模型，提高預測精度。

3 結論

本研究探索了溫度對AFB1污染的10種不同品牌花生油LIF光譜信號的影響規律，結果表明隨著溫度的升高，光譜輪廓形狀幾乎沒有變化，但熒光強度隨著溫度的升高會出現不同幅度降低，表明溫度對AFB1特征熒光強度有較強干擾。使用5種不同建模方法建立全局模型，通過比較預測結果發現SVM(RBF)方法所建立的全局模型預測效果最優，其正確率超過99%，FNR為0，FPR為0.6%。在此基礎上使用SVM(RBF)建立分溫度模型，并使用各分溫度模型分別對5個溫度下驗證集進行預測，結果表明各分溫度模型在預測本溫度驗證集時，預測效果極優，正確率均高于97%，驗證集FPR與FNR不超過5.5%，但在預測其他溫度驗證集時，效果極差。這表明使用LIF技術檢測花生油AFB1含量時，當樣本溫度不一致時，通過建立全局模型能夠提高判別模型的魯棒性。為了更加符合實際應用要求，后續研究需要針對自然AFB1污染花生油樣本進行檢測，探索建立適用的、魯棒性強的判別模型。