重金屬鎘及鹽脅迫對白榆幼苗生理特性的影響

韓淑敏楊立科布和徐歡周靜宇徐燕

(1.內蒙古農業大學 林學院,呼和浩特 010018;2.鄂爾多斯市規劃編制研究中心,內蒙古 鄂爾多斯 017100;3.內蒙古師范大學二連浩特國際學院,內蒙古 二連浩特 011100;4.鄂爾多斯市社會保險事業服務中心,內蒙古 鄂爾多斯 017100)

0 引言

近年來,農業和工業飛速發展,各種重金屬通過農藥化肥、采礦冶金和非法排放污水等不斷進入土壤中。有研究表明這些重金屬污染對植物和動物造成破壞,甚至通過食物鏈給人類健康造成危害[1-2]。2014年,環境保護部(現為生態環境部)、國土資源部(現成為自然資源部)聯合發布《全國土壤污染狀況調查公報》,全國土壤環境狀況不容樂觀,其中從污染物超標情況看,重金屬鎘的超標率達到了7.0%[3]。2018年,生態環境部發布《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準》(GB 15618—2018),依據農用地土壤污染風險管制值規定,土壤中鎘小于等于4.0 mg/kg表明土地污染風險高,原則上應當采取禁止種植食用農產品、退耕還林等嚴格管控措施[4]。土壤鹽堿化是世界性生態環境問題,對于農業、林業生產有著重要的影響[5]。目前鹽堿化土地占我國國土面積的1/4,主要集中在東部沿海地區、中西部干旱及半干旱地區[6]。隨著經濟社會的發展,工業污染問題、氣候變化異常和不合理的施肥灌溉等致使土壤鹽堿化面積逐年增加[7]。

目前針對土壤復合污染問題,利用植物修復受污染的土壤成為研究和應用熱點,具有經濟成本低、適應性廣和操作簡單等優點,對環境恢復功能有明顯持久效果[8-9]。曹婧等[10]研究發現,隨著錳脅迫梯度不斷升高,紫花苜蓿的株高、生物量、酶活性出現先增加后減少的趨勢,丙二醛(MDA)含量則呈現上升趨勢。朱秀紅等[11]研究表明,隨著鎘脅迫水平質量濃度的增加,白花泡桐的葉綠素含量和過氧化氫酶(CAT)活性出現上升趨勢,超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量呈現先升高后降低的趨勢,其對復合重金屬污染土地具有有效的生態恢復潛力。張曉曉[12]采用土培法,探討了3個白榆品系對鹽脅迫的響應機制。研究表明,3種白榆品系耐鹽性閾值均大于155 mmol/L,隨著鹽脅迫梯度的上升,白榆MDA、可溶性蛋白(SP)含量出現先上升后下降,葉綠素含量隨著脅迫增加出現下降的趨勢。

白榆(Ulmuspumila)又名家榆,榆科(Ulmaceae)榆屬(Ulmus)喬木,屬典型的北溫帶落葉闊葉樹種[13],是我國經濟和生態價值較高的樹種之一,能夠有效保持水土保護生態[14-15]。有研究表明白榆對干旱[16]、鹽堿[17]及重金屬污染[18-20]等有較強的抗性。土壤污染問題并不是單一出現的,更多情況是多種污染源以組合形式出現土壤復合污染[21],目前針對白榆復合重金屬脅迫的研究相對較少。本研究利用土培試驗,研究不同含量梯度的Cd、NaCl單一及復合脅迫下,白榆的生理生化特性,對修復Cd、NaCl污染土壤提供科學依據,以期探討白榆經濟生態價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年7—9月在內蒙古農業大學林學院一樓溫室大棚中進行,試驗期間溫室大棚內溫度為22～35 ℃,相對濕度為50%～60%,試驗材料為發育正常生長健壯的1年生白榆苗。

1.2 試驗方法

選取長勢基本一致的白榆苗共48株,于2021年4月用高30 cm、內徑20 cm的塑料花盆進行移栽,栽培基質為營養土和蛭石( 體積比為1∶1)。依據《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準》(GB 15618—2018),并結合預試驗所得結果設置Cd、NaCl處理質量濃度,其中Cd質量濃度水平分別設置為0 mg/L(CK)、 10 mg/L(C1)、25 mg/L(C2)、50 mg/L(C3);NaCl質量濃度水平分別設置為0 mmol/L(CK)、300 mmol/L(N1)、500 mmol/L(N2)、700 mmol/L(N3);Cd加入NaCl復合脅迫處理為C1N1、C2N1、C3N1、C1N2、C2N2、C3N2、C1N3、C2N3、C3N3;NaCl中加入Cd復合脅迫處理為N1C1、N2C1、N3C1、N1C2、N2C2、N3C2、N1C3、N2C3、N3C3,每個處理3個重復。白榆苗在溫室大棚緩苗3個月,日常澆水殺蟲每周澆200 mL的Hoagland營養液保持植物正常生長。自土培試驗開始,每隔5 d每盆澆200 mL相應水平質量濃度的Cd、NaCl溶液進行重金屬脅迫處理,共脅迫60 d。

1.3 測定指標與方法

在脅迫60 d后,取植株相同部位的葉片,進行生理生化指標測定,如:葉綠素、丙二醛(MDA)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)。其中,葉綠素含量測定采用80%丙酮法,稱取0.2 g樣品,加入少量碳酸鈣粉和3 mL的80%丙酮提取液研磨,再加丙酮10 mL繼續研磨至組織發白后,放黑暗處靜置5 min,用濾紙過濾到25 mL容量瓶最后定容至25 mL,將稀釋后葉綠體色素提取液倒入到比色杯內,在663 nm和646 nm波長下測定吸光度;丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法,稱取0.3 g樣品加入5 mL 5%TCA(三氯乙酸),充分研磨勻漿4 000 r/min離心10 min,取得上清液2 mL加入2 mL0.67%TBA(硫代巴比妥酸)混合后沸水浴30 min,冷卻后再次離心10 min,取上清液分別在450、532、600 nm處檢測吸光值;過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚法,稱取樣品0.5 g于預冷的研缽中加入5 mL預冷的磷酸緩沖液(0.05 mol/L,pH 7.8),冰浴中充分研磨在4 ℃下8 000 r/min 離心20 min,上清液即為粗酶液。 測定POD的活性時,以加入3 mL反應混合液和1 mL磷酸緩沖液(pH 7.8)的比色皿作為校零對照,以3 mL反應混合液加1 mL上述粗酶液作為試驗組。校零后,立即開啟秒表計時,于470 nm波長處測吸光度(OD)值,每隔30 s讀取一次共讀5次。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法,將1.5 mL的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)、0.3 mL的130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液、0.3 mL的750 μmol/L氮藍四唑(NBT)溶液、0.3 mL的100 μmol/L EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二鈉)液、0.3 mL的20 μmol/L核黃素、0.05 mL的粗酶液及0.25 mL蒸餾水混合后,一支對照管置于暗處,其他試管于4 000 lx日光下反應10 min。反應結束后,以暗處的試管做空白對照,分別在560 nm波長測定其他各管的吸光度。

1.4 數據處理

采用Excel 2016軟件整理計算數據;采用SPSS 26.0軟件對數據進行單因素方差分析,其中顯著性檢驗:P＞0.05是無顯著相關,P≤0.05是顯著相關,P≤0.01是極顯著相關;采用Origin 2018軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 Cd、NaCl單一及復合脅迫對白榆葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用產生的主要色素,在植物光合作用的光吸收中起核心作用,隨著植物破壞和逆境加劇,植物內體葉綠素含量變化可作為其抗性研究的主要參考指標。由圖1可知,單一Cd脅迫下總葉綠素含量隨著Cd梯度增加出現下降趨勢,C3下降幅度最大,比對照顯著下降了46.22%;單一NaCl脅迫下總葉綠素含量隨著NaCl梯度增加比對照出現明顯下降趨勢,其中N1、N2、N3分別比對照下降了59.20%、70.98%、77.10%,表明NaCl脅迫對白榆總葉綠素含量影響比Cd脅迫效果更顯著。Cd、NaCl復合脅迫時,在同一Cd脅迫中添加NaCl對白榆總葉綠素含量影響如圖1(a)所示,單一Cd脅迫梯度變化幅度較小,加入N1梯度的Cd脅迫顯著低于不添加NaCl的Cd脅迫梯度,其中C1N1比C1梯度下降了62.10%,C2N1比C2梯度下降了62.18%, C3N1比C3梯度下降了51.32%;在同一NaCl脅迫中添加Cd對白榆總葉綠素含量影響如圖1(b)所示,Cd脅迫對白榆總葉綠素含量的影響比NaCl脅迫影響小,添加不同梯度的Cd對于NaCl脅迫變化幅度不明顯,但仍然能看出下降趨勢,其中N1C3比N1梯度下降了35.85%,N2C3比N2梯度下降了31.22%,N3C3比N3梯度下降了40.50%。由此說明,單一Cd脅迫對于白榆總葉綠素含量的影響小于單一NaCL脅迫,隨著復合脅迫梯度的增加,白榆總葉綠素含量逐步減少,說明復合土壤污染對白榆生長發育有明顯抑制作用。顯著性分析表明,Cd、NaCL單一及復合脅迫的組間與組內均有顯著差異(P≤0.05)。

圖1 Cd、NaCl單一及復合脅迫對桑樹總葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the phlorophyll of Ulmus pumila

2.2 Cd、NaCl單一及復合脅迫對榆樹MDA含量的影響

MDA是生物體內自由基作用于脂質發生過氧化反應產生的氧化終產物,在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是常用的指標。植物器官衰老或者逆境下細胞會損傷,其含量可以反映植物遭受衰老或逆境傷害的程度。由圖2(a)可知,單一Cd脅迫下MDA含量隨著Cd梯度增加出現上升趨勢,但單一Cd脅迫下MDA含量變化不顯著,說明Cd對白榆生長發育破壞程度較小。由圖2(b)可知,單一NaCl脅迫下MDA含量隨著NaCl梯度增加出現較為明顯的上升趨勢,其中N1、N2、N3分別比對照上升了66.55%、77.57%、86.59%。由圖2可知,NaCl脅迫對白榆MDA含量影響比Cd脅迫效果更顯著,表明NaCl脅迫比Cd脅迫對白榆傷害程度更高。Cd、NaCl復合脅迫時,在同一Cd脅迫中添加NaCl對白榆MDA含量影響如圖2(a)所示,單一Cd脅迫梯度變化幅度較小,加入NaCl梯度的C3脅迫比不添加NaCl梯度的C3脅迫顯著上升,其中C3N1、C3N2和C3N3分別比C3梯度上升了57.31%、73.71%、77.66%;在同一NaCl脅迫中添加Cd對白榆總葉綠素含量影響如圖2(b)所示,Cd脅迫對白榆MDA含量的影響比NaCl脅迫影響小,添加不同梯度的Cd對于NaCl脅迫變化幅度不明顯,但仍然能看出上升趨勢,其中N1C2比N1C3梯度上升了28.94%,N2C2比N2C3梯度上升了31.13%。由此說明,單一NaCl脅迫對于白榆MDA含量的影響顯著大于單一Cd脅迫,隨著復合脅迫梯度的增加,白榆MDA含量逐步增加,說明復合土壤污染對白榆器官細胞有破壞作用,對其生長發育有明顯抑制作用。顯著性分析表明,Cd單一脅迫的組內顯著性差異較小(P＞0.05), NaCl單一脅迫及復合脅迫的組間與組內均有顯著差異(P≤0.05)。

圖2 Cd、NaCl單一及復合脅迫對白榆MDA含量的影響Fig.2 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the MDA of Ulmus pumila

2.3 Cd、NaCl單一及復合脅迫對白榆POD活性的影響

POD廣泛存在于植物體中是一種活性較高的酶,與光合作用、呼吸作用及生長素的氧化反應等都有關系,所以POD是植物老化和逆境生理的常用指標之一。由圖3可知,單一Cd脅迫下POD活性隨著Cd梯度增加呈先上升后下降的趨勢,C2到C3梯度POD活性下降了1.75%。單一NaCl脅迫下POD活性隨著CK、N1、N2梯度的增加出現上升趨勢,N3梯度時POD活性出現下降趨勢,其中N1比對照增加了7.02%,表明POD活性在C2、N2梯度時達到極值后開始降低。Cd、NaCl復合脅迫時,在同一Cd脅迫中添加NaCl對白榆POD活性變化如圖3(a)所示,單一Cd和NaCl脅迫梯度變化幅度均較小,加入復合脅迫后POD活性高于單一脅迫梯度,其中C2N2的POD活性值最高比C2梯度升高了19.14%。由3(b)可知,在同一NaCl加入Cd的復合脅迫中,N2C3到N3C3梯度降低了9.25%。由此說明,POD活性變化在Cd、NaCl單一及復合脅迫的組內變化趨勢較典型,分別在第1到第3梯度有顯著上升,到第4梯度時出現下降,證明第3梯度為 POD活性的極值,且復合脅迫對于POD活性變化幅度大于單一脅迫,說明復合土壤污染對白榆的酶活性有更大的影響,對白榆生長發育有明顯抑制作用。顯著性分析表明, Cd、NaCl單一及復合脅迫的組間與組內均有顯著差異(P≤0.05)。

圖3 Cd、NaCl單一及復合脅迫對桑樹POD活性的影響Fig.3 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the POD of Ulmus pumila

2.4 Cd、NaCl單一及復合脅迫對白榆SOD活性的影響

圖4 Cd、NaCl單一及復合脅迫對桑樹SOD活性的影響Fig.4 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the SOD of Ulmus pumila

SOD是生物體內重要的抗氧化酶,廣泛存在于動物、植物和微生物等大量生物體內,植物損傷、衰老及逆境等決定著SOD在生物體內的活性高低,所以SOD活性水平是植物抗氧化機制的重要反應也是逆境生理的常用指標之一。由圖4可知,單一Cd脅迫下SOD活性隨著CK、C1、C2梯度的增加出現上升趨勢,C3梯度時SOD活性出現下降趨勢,其中CK到C1梯度SOD活性上升了166.67%,C2到C3梯度SOD活性下降了18.19%;單一NaCl脅迫下SOD活性變化與單一Cd脅迫變化幅度相同,NaCl隨著質量濃度增加出現先上升后下降的趨勢,其中N1到N2的增幅最大,增加了80.00%,表明SOD活性在C2、N2質量濃度水平時達到極值從C3、N3梯度出現降低趨勢。Cd、NaCl復合脅迫時,在同一Cd脅迫中添加NaCl對白榆SOD活性變化如圖4(a)所示,加入NaCl梯度的Cd脅迫SOD活性水平高于不添加NaCl的Cd脅迫梯度,其中添加N2梯度的Cd脅迫SOD活性水平最高,C1N2比C1升高了290.63%,C2N2比C2顯著升高了265.23%,C3N2比C3升高了306.94%;在同一NaCl脅迫中添加Cd對白榆SOD活性變化趨勢如圖4(b)所示,添加C2梯度的NaCl脅迫變化幅度最大,其中N1C2比N1升高了489.25%,N2C2比N2升高了346.39%,N3C3比N3升高了134.38%。由此說明,SOD活性水平變化在Cd、NaCl單一及復合脅迫的組內及組間變化趨勢較顯著,分別在第1到第3梯度有大幅上升,到第4梯度時出現下降趨勢,證明第3梯度時達到SOD活性的極值,且復合脅迫對于SOD活性變化幅度大于單一脅迫,說明復合土壤污染對白榆的抗氧化酶有更大的響應,對白榆生長發育有明顯抑制作用。顯著性分析表明,Cd單一脅迫的組內顯著性差異較小(P＞0.05), NaCl單一脅迫及復合脅迫的組間與組內均有顯著差異(P≤0.05)。

Cd、NaCl單一及復合脅迫實驗過程中,白榆幼苗隨著時間推移葉片和根系表型發生不同變化。總體上白榆葉片表型變化是復合脅迫最明顯,其次是NaCl脅迫最后是Cd脅迫。60 d后N3C3、N2C2梯度白榆幼苗葉片全部枯黃發干葉片掉落明顯,其他梯度的復合脅迫葉片發黃葉片邊緣出現干皺的現象,NaCl脅迫下白榆隨著質量濃度變化葉片逐步呈灰黃色且掉落明顯,Cd脅迫下葉片表型變化不顯著,只有C3梯度葉片有明顯發黃掉落,CK、C1及C2梯度葉片均呈現健康的深綠色且葉片中含有水分無明顯掉落現象。

3 討論

葉綠素含量是判斷植物進行光合作用的重要指標,葉綠素含量的變化能夠體現植物對逆境脅迫環境的適應性[22-23]。李欣航等[24]研究結果表明,隨著Mn脅迫梯度增加雞眼草葉綠素含量逐步降低,高質量濃度的Mn會破壞葉綠體的結構阻礙葉綠素的合成,從而導致葉綠素含量的降低,影響其光合作用,與本試驗的結果一致。Cd脅迫會破壞白榆葉片中葉綠體結構,降低葉綠素的含量,阻礙植物正常發育生長,與孫博文等[25]、張金彪等[26]的研究相吻合。在本試驗中,NaCl脅迫對白榆葉片的破壞程度高于Cd脅迫,在Cd、NaCl復合脅迫中葉綠素含量也出現逐步降低的趨勢,其中N1C1、N1C2、N1C3分別比C1、C2、C3的葉綠素含量出現大幅下降,表明N1梯度對植物光合作用的影響最大,抑制了葉綠素合成,總體來說,Cd、NaCl復合脅迫的葉綠素含量顯著低于同一梯度的單一Cd脅迫。

丙二醛(MDA)是植物細胞膜脂過氧化作用的最終產物,通過植物膜脂過氧化程度的高低來判斷植物在逆境中的傷害程度,MDA含量與膜脂過氧化程度呈正相關,即脅迫梯度越高MDA含量越高。周慧等[27]研究表明隨著重金屬Cd質量濃度的升高,5種濕生觀賞植物的MDA含量均呈現不同程度的升高,說明由于重金屬脅迫5種濕生植物的細胞膜脂過氧化反應明顯,造成不同程度的傷害,與本研究結論一致。胡博等[28]研究發現,鹽脅迫對不同種源的桑樹也有顯著影響,其MDA含量由雞桑到龍桑到蒙桑逐步增加,隨著鹽質量濃度的升高及時間的延長,不同種源桑樹無法抵御鹽脅迫的傷害,證明鹽脅迫對不同種源的桑樹細胞結構均產生破壞,導致MDA含量的增加。本試驗中白榆隨著單一Cd、單一NaCl及Cd、NaCl復合脅迫作用下MDA含量逐步升高,表明其破壞程度從大到小為:Cd、NaCl復合脅迫、單一NaCl脅迫、單一Cd脅迫。

POD能夠將植物體內的H2O2分解為O2和H2O,從而使植物體的H2O2清除免受植物老化和逆境生理的傷害作用[29]。POD與植物的光合作用、呼吸作用等氧化反應息息相關,因此作為本試驗的生理指標之一。孟長軍[30]研究表明隨著鋁脅迫梯度增加,白苦瓜幼苗葉片中的POD活性水平呈現先增加后降低的趨勢,在100 mg/L的鋁脅迫梯度下POD活性水平達到最高峰,隨著鋁脅迫質量濃度增加,白苦瓜幼苗的POD活性水平顯著低于對照。這與本實驗研究結果一致,單一Cd、NaCl及復合脅迫下,POD活性在第3梯度時達到最高值,在第4梯度時出現下降,且復合脅迫對于桑樹POD活性影響高于單一脅迫。在一定質量濃度下,白榆通過增加POD活性穩定細胞膜結構來響應逆境脅迫對植物抗氧化系統的損害,但達到更高質量濃度時,維穩能力逐漸喪失,POD活性隨之出現下降趨勢。這與許愛祝等[31]對于麻瘋樹幼苗根系重金屬抗逆性研究結果一致,當Cu質量濃度達到200 mg/L時,麻瘋樹幼苗根系POD值降到最低,植株基本死亡。

SOD防御超氧陰離子自由基對植物細胞的破壞,保護植物細胞在老化、損傷及逆境時免受氧化損傷[32]。柯野等[33]研究低磷脅迫對甘蔗SOD活性有顯著影響,隨著低磷脅迫梯度變化,SOD活性逐步升高,其主要原因是低磷脅迫下甘蔗內會產生大量的活性氧自由基,刺激SOD活性增強以防御超氧陰離子對植物內部的破壞,從而提高甘蔗對逆境的防御能力,減少對植株的傷害。但SOD活性只能在一定范圍內有效去除重金屬對植物細胞的損傷,隨著逆境環境加重,SOD活性會逐漸下降。這與周洋等[34]關于輪葉黑藻在鉛鋅脅迫下的生理響應研究結果不一致,輪葉黑藻隨著重金屬梯度的增加SOD活性水平出現持續上升趨勢,可能是由于重金屬脅迫質量濃度的持續升高導致活性氧自由基出現紊亂現象,無法抵御超氧陰離子自由基,超氧化物歧化酶遭到破壞。

綜上所述,Cd、NaCl復合脅迫對白榆的葉綠素含量、MDA含量、POD活性及SOD活性等生理特性比單一Cd、NaCl脅迫的脅迫作用更大;單一Cd、NaCl脅迫處理下,單一NaCl脅迫對白榆的葉綠素含量、MDA含量及POD活性水平比單一Cd脅迫脅迫作用更大;Cd、NaCl單一及復合脅迫處理下,白榆POD活性和SOD活性表現為低質量濃度上升高質量濃度下降的趨勢; Cd脅迫水平在0～200 mg/L范圍內,NaCl脅迫水平在0～500 mmol/L范圍內白榆POD活性與SOD活性呈上升趨勢,植物能正常生長有效抗逆,高于此質量濃度后白榆POD活性與SOD活性出現下降趨勢,證明植物達到抗逆性的極值。