一株稻田土壤梭狀芽孢桿菌的分離及其固氮產氫能力研究

吳志宇，周革非，陳慧敏，湯 佳，謝章彰*，劉芳華*

1. 煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264003

2. 廣東省科學院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，華南土壤污染控制與修復國家地方聯合工程研究中心，廣東省農業(yè)環(huán)境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650

3. 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006

分子氫(H2)在水稻田土壤中扮演著重要角色.首先，H2作為一種理想的電子供體，能夠被產甲烷菌、固氮菌、異化鐵還原菌等微生物利用，并參與鐵/錳氧化物、CO2等物質的還原過程[1-4]. 其次，稻田土壤重金屬含量是水稻種植中需嚴格控制的環(huán)境因素[5-6]，H2可以通過還原作用固定諸如鉛、鎘等重金屬，減輕土壤重金屬污染程度，如H2可以與硫酸鹽還原過程耦合，產生的硫離子可以與鉛、鎘等重金屬離子結合并沉降[7]. 此外，H2處理能夠加快水稻種子萌發(fā)、促進幼苗根系的生長，還可以降低水稻對重金屬的吸收量. 由于產氫微生物的產氫活動是稻田土壤中H2的主要來源[8]，因此，產氫微生物對稻田土壤微生物的代謝活動及水稻的生長起著重要作用.

在水稻田土壤中，氮源是一種重要的營養(yǎng)元素，影響作物的生長及水稻田生態(tài)系統的穩(wěn)定. 氮源的輸入對水稻等作物的產量影響極大. 除人工施肥外，固氮微生物的固氮作用是水稻田中氮素的重要來源. 固氮微生物可以將N2在固氮酶作用下轉化為氨態(tài)氮，并轉化為氨基酸等有機物供給生物體生長[9]. 常見的固氮微生物有固氮菌屬(Aztobacersp.)、克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[10-11]. 固氮反應同時也是放氫過程，但固氮菌的產氫能力有限，絕大部分固氮作用產生的H2會被固氮菌自身利用[12].

目前，針對水稻田土壤中單獨具有產氫能力和固氮能力微生物的研究較多，如王永忠等[13]發(fā)現從稻田淤泥中可以篩選得到高效產氫菌；金月波[14]發(fā)現，額外施加稻田來源的固氮菌能夠顯著提高水稻的株高、鮮質量和干質量. 然而，關于具有協同固氮產氫能力微生物的研究卻仍舊缺乏，針對此類微生物的挖掘和研究將有助于揭示稻田土壤中協同固氮-產氫微生物的生態(tài)作用，并為其實際應用提供理論基礎. 該研究從華南稻田土壤樣品中定向篩選具有協同固氮產氫能力的微生物，并對其固氮產氫特性進行研究，以期為研究稻田微生物協同固氮產氫過程提供新的微生物資源.

1 材料與方法

1.1 樣品獲取

采集華南稻田(113°52′51″E、23°03′43″N)土壤樣品：于2021年12月，用取樣器采集深度為0~40 cm的稻田土1.5 kg，用聚乙烯樣品袋盛放樣品，4 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2 產氫富集物培養(yǎng)

將50 g土壤樣品與500 mL去除氮源的MSG培養(yǎng)基[15](MSG-N?培養(yǎng)基)混合(去除蛋白胨、半胱氨酸和氯化銨)，用磁力攪拌器混勻，并通入高純氮氣(N2)除氧30 min. 用移液管將混合懸濁液分裝至120 mL的厭氧瓶中，每瓶50 mL，用膠塞封口，放置于37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育5~7 d；之后每3 d轉接一次，轉接量為5%，培養(yǎng)基為無菌除氧的MSG培養(yǎng)基.

MSG-N?培養(yǎng)基成分：NaCl 5 g，K2HPO42.1 g，KH2PO40.54 g，微量元素溶液10 mL，葡萄糖10 g，蒸餾水1 L.

微量元素濃縮液成分：NaCl 6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，MgCl2·6H2O 2 g，FeCl2·4H2O 40 mg，ZnCl21 mg，MnCl2·4H2O 1 mg，CuCl2·2H2O 0.6 mg，AlCl31 mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1 mg，CoCl3·6H2O 4 mg，硼酸飽和溶液20 μL，濃鹽酸20 μL，生物素0.04 mg，葉酸0.04 mg，維生素B60.2 mg，核黃素0.1 mg，維生素B10.1 mg，煙酸0.1 mg，維生素B120.1 mg，對氨苯甲酸0.1 mg，泛酸0.1 mg，蒸餾水1 L.

1.3 產氫菌的分離和鑒定

將富集物逐級稀釋104~107倍，用Hungate滾管法分離單菌落[16]. 將滾管后冷卻的厭氧管放置于37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)48 h. 在厭氧箱中挑取單菌落，接入200 μL無菌生理鹽水中，再轉接到含有20 mL滅菌除氧的MSG培養(yǎng)基的厭氧瓶中，37 ℃下培養(yǎng). 培養(yǎng)基產生明顯渾濁后，取100 μL菌液作為PCR模板，對其16S rRNA基因擴增，剩余菌液用于傳代和菌種保藏.

PCR擴增體系：2×Taq mix 12.5 μL，通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，菌液模板0.5 μL，ddH2O 10 μL，體系總體積25 μL. PCR程序：預熱95 ℃，5 min. 循環(huán)程序：裂解95 ℃，30 s；退火55℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；循環(huán)30次. 終延伸72 ℃，10 min. 4 ℃下保存. 將產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并送樣于生物工程(上海)股份有限公司測序. 將測序結果上傳NCBI數據庫(Genebank登記號為ON259312.1)，并在該數據庫中進行在線Blast比對. 使用MEGA X繪制系統發(fā)育樹.

1.4 形態(tài)觀察

取2 mL菌液于離心管中，5 000 r/min下離心3 min，用無菌水重懸重復離心，加入2.5%戊二醛5 mL重懸浮，置于4 ℃下環(huán)境過夜，依次用30%、50%、70%、90%和100%濃度的乙醇脫水，將脫水后得到的菌體凍干后噴金鍍膜. 將制備好的樣品置于掃描電鏡(Phenom ProX)下進行微生物形態(tài)觀察[17].

1.5 代謝特征檢測

1.5.1生長檢測

將處于生長期的菌液接種到新鮮MSG培養(yǎng)基中，37 ℃下避光培養(yǎng)，每2 h取樣一次，用紫外分光光度計測量600 nm處的吸光度(記作OD600).

1.5.2底物消耗檢測

使用3,5-二硝基水楊酸法測定樣品中葡萄糖含量[18].

檢測液成分：3,5二硝基水楊酸6.3 g，NaOH 21 g，KNaC4H12O10·4H2O 182 g，苯酚5 g，NaSO35 g，蒸餾水1 L. 4 ℃下靜置7~10 d后使用.

將發(fā)酵液稀釋20倍與檢測液以體積比1∶3混合，100 ℃下水浴5 min. 檢測540 nm處的吸光度.

1.5.3有機酸產物檢測

取0.5 mL菌液，用去離子水稀釋2倍，3 000 r/min下離心3 min，取上清液，通過0.22 μm濾膜. 使用液相色譜(Agilent1260，安捷倫，德國)檢測培養(yǎng)基中有機酸產物(乙酸、乳酸、丁酸)的濃度變化.

液相色譜條件：C18柱(C18-WR 5 μm，島津，日本)，柱溫35 ℃，流動相為18 mmol/L磷酸二氫鉀，流速1.2 mL/min，紫外檢測器，波長為218 nm.

1.5.4產氫量檢測

用氣相色譜進樣針取頂空樣品200 μL，用氣相色譜(Agilent8860，安捷倫，德國)檢測氣體成分，根據標準曲線換算氣體分壓，用自由氣體方程〔見式(1)〕計算H2物質的量.

式中：P為氣體分壓，取值為101 kPa；V為氣體體積，m3；n為氣體物質的量，mol；R為普適氣體常數，取值為8.314 4 J/(mol·K)；T為氣體溫度，取值為198 K.

氣相色譜條件：TCD檢測器，檢測器溫度150 ℃，進樣口溫度80 ℃，柱溫箱80 ℃，N2作載氣，流速10 mL/min.

1.5.5固氮能力檢測

生物量檢測：配制MSG-N?培養(yǎng)基，分別用高純N2和高純氬氣(Ar)除氧并滅菌. 接種BZ-1種子液，接種量為5%. 分別檢測N2試驗組和Ar試驗組發(fā)酵液600 nm處的吸光度以及培養(yǎng)體系中NH4+濃度.

NH4+濃度檢測：采用靛酚藍-分光光度法[19]. 反應體系和條件：①檢測液A，苯酚10 g，1.25%亞硝基鐵氰化鈉溶液4 mL，蒸餾水1 L；②檢測液B，NaOH 5 g，C6H5Na3O74 g，NaClO溶液7 mL，蒸餾水1 L；③將檢測液A、B各5 mL混合后，加入發(fā)酵液200 μL，37 ℃下孵育15 min，測定637 nm處的吸光度.

固氮酶活性檢測：使用乙炔還原法檢測固氮活性. 取25 mL容積血清瓶，密封后，將氣體置換為Ar，加入1%體積的乙炔氣體，備用. 檢測固氮酶活性時取1.5 mL菌液加入備用的血清瓶中，37 ℃下孵育1.5 h，用氣相色譜檢測乙烯產生量.

1.6 統計學分析

所有試驗均設置3個平行，使用SPSS 23.0軟件對試驗數據進行統計學分析.

2 結果與討論

2.1 產氫菌株的分離與鑒定

富集培養(yǎng)液經過多次傳代后，用Hungate滾管法分離并純化得到一株產氫菌，命名為菌株BZ-1. 菌株BZ-1菌落呈淡黃色，形狀為光滑圓形. 如圖1(掃描電鏡檢測結果)所示，在放大倍數為1.95萬倍的視野下，菌株BZ-1呈棒狀，長3~4 μm，寬0.3~0.5 μm，表面相對光滑.

圖 1 菌株BZ-1掃描電鏡圖像Fig.1 Electron microscope image of strain BZ-1

通過16S rRNA基因序列的測序和比對確定所分離菌株BZ-1的系統發(fā)育地位. 經Blast比對，該菌株與Clostridium pasteurianumDSM525的序列相似性最高，為98.43%. 將BZ-1菌株與另外幾株產氫梭狀芽孢桿菌和其他典型的產氫、固氮菌株的16S rRNA基因序列構建系統發(fā)育樹(見圖2)，發(fā)現菌株BZ-1與Clostridium pasteurianumDSM525處于同一分枝.綜上，菌株BZ-1鑒定為梭狀芽孢桿菌屬.

圖 2 基于16S rRNA基因序列構建的菌株BZ-1系統發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain BZ-1 based on 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株BZ-1產氫特性

避光條件下，在37 ℃的MSG培養(yǎng)基中，5%接種量的菌株BZ-1在60 h內的產氫總量為42.19 mmol/L〔見圖3(a)〕. 菌株BZ-1的生長遲滯期小于5 h，對數期為5~10 h，在17 h左右生物量達到最大，OD600值為1.45，隨后生物量緩慢下降〔見圖3(b)〕. 前27 h葡萄糖消耗較快〔見圖3(d)〕，平均速率為1.30 mmol/(L·h).隨著菌株BZ-1利用葡萄糖產生的有機酸不斷累積，培養(yǎng)基pH不斷下降，當pH<4.3后，菌株BZ-1代謝葡萄糖速率大幅下降，在該體系中，葡萄糖總消耗量為34.55 mmol/L.

通過氣相色譜和液相色譜檢測菌株BZ-1的代謝產物，其發(fā)酵葡萄糖主要產物為H2、CO2和有機酸.菌株BZ-1發(fā)酵產氫的底物轉化率為1.22 mol/mol(以每mol葡萄糖產生多少mol H2計)，有機酸產物主要為丁酸(15.96 mmol/L)，其次為乙酸(7.14 mmol/L)和乳酸(5.09 mmol/L)〔見圖3(c)〕.

2.3 菌株BZ-1固氮能力

菌株固氮生長能力檢測結果如表1所示，菌株BZ-1在MSG-N?培養(yǎng)基中于頂空Ar環(huán)境下培養(yǎng)36 h后，菌株BZ-1的OD600值僅達到0.36，而在N2環(huán)境中，36 h時菌株BZ-1的OD600值為1.47，顯著高于Ar試驗組，說明菌株BZ-1可以通過固氮作用利用N2進行生長.

2.4 菌株BZ-1協同固氮產氫特性

菌株BZ-1在有/無氯化銨的MSG-N?培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的產氫量檢測結果如圖4(a)所示，發(fā)現在以20 mmol/L葡萄糖為底物的發(fā)酵產氫試驗中，無氯化銨試驗組前期產氫速率較慢，但最終產氫量較高，其最高產氫量為30.85 mmol/L，相比于3 mmol/L和7 mmol/L氯化銨氮源試驗組的26.25 mmol/L和26.89 mmol/L分別提高了17.49%和14.71%.

不同氮源含量的MSG培養(yǎng)基中，菌株BZ-1的生物量、底物濃度和pH隨時間的變化以及有機酸產物的最終濃度結果表明，在以N2為唯一氮源的培養(yǎng)體系中，其生物量增長較慢，到達平臺期的時間晚于以氯化銨為氮源的兩個試驗組；菌株BZ-1的最大生物量也更低，相比于添加7 mmol/L氯化銨的試驗組，最大生物量降低了33.33%〔見圖4(b)〕. 在前24 h，相較于未添加氯化銨的試驗組，以氯化銨為氮源的試驗組生物量增長較快，葡萄糖底物消耗較快〔見圖4(c)〕，葡萄糖的快速消耗導致體系內有機酸發(fā)酵產物累積速度加快，使體系pH下降也較快〔見圖4(d)〕. 由于氯化銨的消耗會降低體系pH，所以添加氯化銨作為氮源的試驗組的最終pH也略低于未添加氯化銨的試驗組. 值得注意的是，不同試驗組中的乙酸產量存在明顯差異〔見圖4(e)〕，未添加氯化銨試驗組的乙酸產量為8.79 mmol/L，相比于添加3和7 mmol/L氯化銨的試驗組產乙酸濃度分別提升了63.22%和61.49%.

圖 3 在MSG培養(yǎng)基中菌株BZ-1的代謝情況Fig.3 Metabolism of strain BZ-1 in MSG medium

表 1 菌株BZ-1在N2和Ar環(huán)境的無氮源培養(yǎng)體系中36 h內生物量和NH4+濃度Table 1 The accumulation of biomass and ammonium ions of strain BZ-1 in N2 and Ar environment without nitrogen source

該研究進一步測定了菌株BZ-1在不同培養(yǎng)體系中的固氮能力，發(fā)現在未添加氯化銨的試驗組中，雖然生物量較低〔見圖4(b)〕，但乙炔還原量顯著高于添加7 mmol/L氯化銨的試驗組〔見圖4(f)〕. 這說明在無氯化銨的培養(yǎng)體系中，菌株BZ-1具有較高的固氮酶活性. 同時發(fā)現，產氫停滯后(48 h)BZ-1的固氮能力也大幅下降，表明BZ-1的固氮過程和產氫過程在時間上具有一定的同步性.

圖 4 不同氮源濃度對菌株BZ-1產氫代謝的影響Fig.4 Effects of different nitrogen contents on hydrogen production and metabolism of strain BZ-1

2.5 討論

利用厭氧培養(yǎng)聯合亨蓋特滾管技術，從華南稻田土壤樣品中篩選得到了一株具有協同固氮產氫能力的梭菌BZ-1.

在菌株BZ-1的固氮能力檢測中發(fā)現，菌株BZ-1可以利用N2作為氮源產生生物量，說明該菌株具有固氮生長能力. 兩個試驗組中均未檢測到胞外NH4+，說明菌株BZ-1固定N2產生的NH4+未釋放到胞外，推測BZ-1固氮作用產生的NH4+全部在胞內被用于細胞生長和代謝.

在菌株BZ-1協同固氮產氫的試驗中發(fā)現，協同固氮產氫試驗組的產氫量相較于添加3 mmol/L氯化銨的試驗組增加了14.72%. 可以看出，當固氮作用和產氫作用同時進行時，菌株BZ-1的產氫能力得到了增強. 發(fā)酵產氫培養(yǎng)基中氮源含量充足時，高濃度氮源會抑制固氮酶的活性[20]，因而當培養(yǎng)體系中存在一定濃度的氯化銨時，菌株BZ-1的固氮酶活性較低.H2是微生物固氮作用的副產物[21-22]，菌株BZ-1固氮活性的提高可能有利于其產氫量的提升.

另外，菌株BZ-1協同固氮產氫時的最終生物量低于以氯化銨為氮源生長時的生物量. 由于微生物生物量的增加需要合成各類多糖、蛋白和其他物質，會消耗大量的底物以產生足夠的能量與還原力[23]，因而生物量的下降有利于降低底物的消耗. 在菌株BZ-1協同固氮產氫時，其較低的生物量可能會使更多的底物和還原力流向產氫途徑，最終提升菌株BZ-1的產氫量.

此外，試驗中還觀察到，協同固氮產氫試驗組的乙酸產量顯著增加. 由于[Mo-Fe]固氮酶催化的固氮反應需要消耗大量的ATP與NADH[24]，而相比于產乳酸與產丁酸代謝途徑，產乙酸代謝途徑能夠產生更多的ATP與NADH，所以菌株BZ-1固氮生長時，產乙酸代謝途徑會被上調，并依此提高乙酸產量. 此外，相比于產乳酸和產丁酸途徑，產乙酸途徑的單位底物產氫量更高[25-26]，菌株BZ-1產乙酸代謝途徑的上調將有利于其產氫.

在菌株BZ-1的固氮能力檢測試驗中發(fā)現，菌株BZ-1可以利用N2作為唯一氮源進行生長，但未在培養(yǎng)基溶液中檢測到NH4+，說明在實驗室培養(yǎng)條件下菌株BZ-1不會主動向胞外輸送氮源. 然而在實際稻田土壤的復雜條件下，菌株BZ-1固定的氮源可能會隨著細胞的死亡而釋放到環(huán)境中，并被其他生物所利用[27]. 即菌株BZ-1可能同時具備向稻田土壤中輸入有機氮和H2的能力. 土壤微生物固氮及產氫活性的增強有利于改善土壤肥力、提高農作物產量[28-30]. 例如：柯玉詩等[31]用耐氨固氮菌處理稻田土壤，發(fā)現在低氮條件下早稻和晚稻產量分別提高了8.41%和7.21%；Cheng等[32]發(fā)現，H2處理降低了谷物中的鎘積累量，同時提高了谷物中支鏈淀粉的含量；Zeng等[33]發(fā)現，H2通過調節(jié)激素信號通路，從而影響水稻的抗逆性. 我國是水稻種植大國[34]，菌株BZ-1的協同固氮產氫能力使其可以在提高稻田土壤肥力的同時，提高稻田土壤微生物代謝活性并緩解鉛、鎘等重金屬對水稻的脅迫作用，有利于提高糧食產量、保障糧食安全. 此外，在“雙碳”背景下，梭菌還是一類理想的產氫微生物[21,35]，研究協同固氮產氫作用對提高梭菌產氫效率也有重要意義.

3 結論

a) 該研究從稻田土壤樣品中分離得到一株具有協同固氮產氫能力的梭菌?Clostridium sp. BZ-1.

b) 在有機氮源充足條件下菌株BZ-1發(fā)酵20 mmol/L葡萄糖可以產生26.89 mmol/L的氫氣，當以N2為唯一氮源時，菌株BZ-1產氫量可以提升至30.85 mmol/L.

c) 菌株BZ-1固氮酶活的提升、生物量的降低以及代謝途徑的改變可能是其在固氮產氫條件下產氫量提升的原因.