miR–100通過Akt/mTOR信號通路對胃癌細胞增殖的負調控作用

郭利華 胡桂梅 丁 勇 王靜靜 葉國良

寧波大學醫學院附屬醫院消化內科，浙江寧波 315020

miR–100 位于人染色體11q24.1，主要參與基因轉錄后調控，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡等細胞信號途徑，與正常組織比較，miR–100 在腫瘤組織中表達異常[1-3]。課題組前期研究發現，胃上皮細胞感染幽門螺桿菌后miR–100 表達異常，與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相關信號通路相關[4]，進一步對胃癌細胞系進行miR–100 檢測，發現胃癌細胞miR–100 較胃黏膜上皮細胞表達下降，考慮miR–100 可能參與胃癌發展進程。miR–100 作為miR–99 家族中的重要成員，研究已證實其與腫瘤的發展進程密切相關，在多種惡性腫瘤中發現miR–100 表達降低[1,3,5]。mTOR 是miR–100 靶基因之一，miR–100 可通過調控mTOR等靶基因表達發揮抑癌作用[4,5]。本項目擬采用miR–100 模擬劑轉染BGC–823 細胞，檢測miR–100對胃癌細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡及對蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/mTOR 信號通路的影響，探討胃癌細胞增殖、凋亡與 miR–100 調控Akt/mTOR 信號通路之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株BGC–823、SGC–7901、MKN–45和人正常胃黏膜上皮細胞株GES–1 均購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT–PCR）引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司；轉染試劑mimics、inhibitor、mock及mTOR–WT、mTOR–MUT 購于Invitrogen 公司；RPMI–1640、MEM、DMEM 培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于Invitrogen 公司；Total RNA抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆轉錄試劑盒PrimerScript RT Master Mix 購于Spark Jade 公司；RIPA 裂解液購于Spark Jade 公司；CCK–8 試劑盒、Annexin V–FITC 凋亡試劑盒購于Bioss 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；一抗及二抗均購于CST公司。

1.2 細胞轉染

選擇對數生長期的BGC–823 細胞種植于6 孔板中（每孔3×104～5×104個）；將miR–100 模擬劑（mimics）、對照（mock）和LipofectamineTM2000試劑分別稀釋至適量的Opti–MEM無血清培養基中，在室溫下放置5min。將miR–100 mimics 和對照組分別與LipofectamineTM2000 轉染試劑混合，室溫下放置20min。最后將轉染復合體（siRNA–LipofectamineTM2000 復合物）分別加入每一個包含50%～60%細胞的培養孔中。在培養箱孵育，按相應實驗需要收集細胞。

1.3 CCK–8 實驗

細胞轉染后，向96 孔板加入細胞100μl/孔（約1×103個）。放入細胞培養箱中培養24h、48h 及72h，向各孔加入10μl 的CCK–8 細胞增殖檢測溶液，培養箱中孵育2h，使用伯樂酶標儀在450nm 波長處檢測每孔的吸光度值。每組共設置5 個復孔，計算平均吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.4 細胞周期

細胞轉染72h 后，將各組細胞用胰蛋白酶消化，細胞離心后接著用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌2 次，每次1000g 離心5min；棄上清后用預冷的70%的乙醇固定，4℃過夜；細胞離心后去除乙醇，PBS 洗滌2 次，然后加5μl 的RNA酶（5g/L），室溫條件下處理15min；每管內加5μl的碘化丙啶（propidiumIodide，PI）染色液，室溫避光情況下孵育30min；1h 內流式檢測，應用ModFit LT?軟件分析細胞周期結果。

1.5 細胞凋亡

細胞轉染72h 后，將各組細胞用胰蛋白酶消化，收集5×105個細胞，以PBS 洗滌，加入400μl 的Binding Buffer，將細胞混勻，再添加5μl 的Annexin V–FITC 溶液，混勻后于4℃避光反應15min，加入PI 染色液，繼續在4℃反應10min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

1.6 定量反轉錄聚合酶鏈反應

用Trizol 裂解液萃取細胞總RNA，測濃度后反轉錄為互補DNA，用miScript SYBR Green PCR kit進行實時定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT–PCR）檢測，反應條件：預變性95℃ 30s，PCR反應95℃ 5s，60℃ 34s，共40 個循環。應用2–??Ct法測定基因的相對表達量，以U6、GAPDH 為標準內參，每組設置3 個復孔，所用引物見表1。

1.7 靶基因預測及雙熒光素酶報告基因驗證

將miR–100 的mimics 或其空載體與載有野生型mTOR–WT 質?；蚩兆冃蚼TOR–MUT 質粒共轉染BGC–823 細胞，轉染48h 后收集細胞，通過酶標儀檢測細胞熒光素酶活性，以海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶活性比值判斷細胞活性。

1.8 蛋白質印跡法

用RIPA 裂解液抽取細胞總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。蛋白樣品中添加5×Loading buffer 放入沸水中5min 使其變性。每孔加入等量的蛋白樣品，恒壓電泳，取出已完成電泳的SDS–PAGE 膠，將蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液中封閉1h 后，PVDF 膜加入一抗，在4℃冰箱過夜，TBST 洗膜，然后在室溫下孵育二抗1h，TBST 洗膜，ECL 顯色，X 光片曝光、顯影，GAPDH 作為內參，結果分析。

1.9 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用One–way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用LSD–t檢驗，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞株miR–100 表達降低

胃黏膜上皮細胞株 GES–1 與胃癌細胞株BGC–823、SGC–7901、MKN–45 的miR–100 相對表達量依次為0.998±0.221、0.386±0.043、0.690±0.072、0.494±0.057，胃癌細胞株miR–100 表達量均顯著低于胃黏膜上皮細胞株（F=13.727，P=0.002），見圖1。miR–100 在BGC–823 中表達水平最低，因此選擇BGC–823 進行后續研究。

圖1 胃癌細胞株與胃黏膜上皮細胞株miR–100 表達水平比較

2.2 轉染miR–100 對BGC–823 胃癌細胞增殖的影響

miR–100 mimics 組miR–100 表達水平顯著高于對照組（P<0.01）。miR–100 mimics 組48h 450nm 的吸光度值顯著低于對照組[（0.823±0.059）vs（1.133±0.112），t=4.894，P=0.003]，72h 450nm 的吸光度值顯著低于對照組[（1.017±0.075）vs（1.343±0.112），t=6.937，P<0.001]，見圖2。

圖2 轉染miR–100 對BGC–823 細胞增殖的影響

2.3 轉染miR–100 對BGC–823 細胞周期的影響

miR–100 mimics組G0/G1期細胞比率顯著高于對照組[（65.59%±0.86%）vs（55.82%±0.64%），t=15.865，P<0.001]，S 期細胞比率顯著低于對照組[（23.98%±1.24%）vs（27.02%±0.81%），t=6.324，P=0.003]，G2/M 期細胞比率顯著低于對照組[（10.32%±1.82%）vs（17.15%±0.45%），t=3.553，P=0.024]，見圖3。

圖3 轉染miR–100 對BGC–823 細胞周期的影響

2.4 轉染miR–100 對BGC–823 細胞凋亡的影響

miR–100 mimics 組細胞凋亡率（11.26%±1.46%）略高于對照組（9.05%±1.23%），但兩組間比較差異無統計學意義（t=2.594，P=0.060），見圖4。

圖4 轉染miR–100 對BGC–823 細胞凋亡的影響

2.5 miR–100 靶基因雙熒光素酶報告基因驗證

在轉染克隆有mTOR–WT 基因3'UTR 質粒的實驗中，miR–100 mimics 組細胞熒光素酶活性顯著低于對照組[（0.46±0.05）vs（1.05±0.08），t＝10.780，P<0.001]；在轉染克隆有mTOR–MUT 基因3'UTR質粒的實驗中，miR–100 mimics 組和對照組熒光素酶活性比較差異無統計學意義[（1.01±0.07）vs（0.95±0.06）；t＝1.540，P=0.198]，見圖5。

圖5 雙熒光素酶報告基因檢測miRNA‐100 對靶基因mTOR 調控作用

2.6 miR–100 對BGC–823 胃癌細胞Akt/mTOR 表達的影響

BGC–823 細胞轉染72h 后，胃癌細胞中Akt、mTOR、p70S6K mRNA 及蛋白表達均顯著降低（P<0.05），而PI3K mRNA 及蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05），見圖6。

圖6 BGC–823 細胞轉染72h 后Akt/mTOR 信號通路表達變化

3 討論

研究顯示miR–100 影響腫瘤細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等生物學過程[2,6-8]。Cao 等[3]研究發現與癌旁組織相比，胃癌組織中miR–100 表達水平顯著降低；Peng 等[9]發現與正常胃黏膜上皮細胞GES–1比較，數種胃癌細胞株如SUN–1、AGS 及HGC–27的miR–100 表達水平顯著降低，本研究結果顯示胃癌細胞株miR–100 表達水平顯著低于胃黏膜上皮細胞株，與既往研究結果相符，提示miR–100 可能參與胃癌的發病過程。

通過細胞轉染技術，將miR–100 模擬劑轉染至人胃癌細胞BGC–823，結果發現，轉染48h、72h 后細胞增殖率較對照組顯著降低，表明miR–100 可降低胃癌細胞增殖活性。Ye 等[10]研究證實miR–100–5p模擬劑可抑制前列腺癌LNCaP、PC–3 細胞系的增殖活力，同時還可抑制LNCaP、PC–3 細胞的侵襲與遷移。流式細胞儀檢測分析結果提示，轉染后胃癌細胞周期停滯在G0/G1期，S 期及G2/M 期細胞比率明顯下降，表明miR–100 轉染使胃癌細胞周期發生變化。Peng 等[9]研究發現AGS 胃癌細胞株miR–100 過表達可促進細胞凋亡，而MGC–803 胃癌細胞株miR–100 低表達對細胞凋亡無明顯影響。推測miR–100對細胞凋亡的影響可能與胃癌細胞分化程度有一定相關性，本研究結果提示miR–100 mimics 組細胞凋亡率雖略高于對照組，但兩組比較差異無統計學意義。因此，miR–100 對胃癌細胞凋亡的影響仍有待進一步研究。

TargetScan 分析發現miR–100 有包括mTOR、FZD5、FZD8、IGF1R 在內的多個靶基因，閱讀相關文獻，以上靶基因與胃癌均有相關性。Lin 等[11]通過雙熒光素酶報告實驗證實mTOR 是miR–100 的目的基因之一。因此本研究將mTOR 作為目的基因，通過熒光報告驗證野生型mTOR 轉染后熒光活性明顯受抑制，mTOR 表達下調明顯。因此，可認為mTOR是miR–100 轉錄后調控的重要靶基因。

mTOR 是Akt 下游關鍵底物之一，研究發現胃癌組織中Akt/mTOR 信號通路相關基因也存在異常表達，Akt/mTOR 異?；罨蓪е挛赴┘毎麗盒栽鲋?、凋亡受阻、周期轉運加速，并促使腫瘤血管再生和細胞侵襲轉移[12,13]。Akt/mTOR 信號通路參與細胞轉錄翻譯、細胞周期、凋亡及血管新生等腫瘤細胞生物學過程[14]。在腦腫瘤、乳腺癌、卵巢癌等研究中發現Akt/mTOR 蛋白酶鏈式反應能加速細胞周期、相對縮短G1期，使細胞增殖異?；钴S，減少細胞凋亡，從而促進腫瘤迅速生長[15-17]。mTOR 激活可使下游核糖體S6 蛋白激酶（p70S6K）磷酸化，促進蛋白質合成[16]。本研究發現胃癌細胞株BGC–823轉染后，Akt/mTOR 信號通路Akt、mTOR、p70S6K基因及蛋白表達明顯降低，而Akt、mTOR 及p70S6K是細胞增殖、細胞周期調控等細胞進程中的重要分子，影響這些基因及蛋白的表達勢必影響細胞的增殖、細胞周期等活動，而miR–100 mimics 具有抑制細胞增殖、阻滯細胞周期進程的作用。

綜上，miR–100 在胃癌細胞中低表達，miR–100 靶向調控mTOR 抑制胃癌細胞增殖，阻礙細胞周期進程，可能與調控Akt/mTOR 信號通路相關蛋白表達有關。