細胞焦亡的作用機制及其在肺纖維化中的研究進展

茹美華 劉迎博 李建強，2

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一類病因不明的的慢性進行性肺間質疾病，患病人數較多，疾病預后相對較差。細胞焦亡(pyroptosis)是近來發現的一種由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)介導的程序性細胞死亡方式。很多研究表明，細胞焦亡在呼吸系統疾病尤其是肺纖維化的發病中起著重要作用，炎性小體等相關因素可通過誘導細胞焦亡的發生參與肺纖維化的發生發展過程。本文就細胞焦亡的作用機制及其參與肺纖維化發生發展及治療方面的相關研究進展做一綜述。

細胞焦亡概述

細胞死亡的方式主要分為兩大類，即程序性死亡和非程序性死亡，其中細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種由基因調控的細胞自主死亡方式，主要包括細胞凋亡(apoptosis)、壞死性凋亡(necroptosis)、細胞焦亡(pyroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)、自噬(autophagy)和胞葬(efferocytosis)[1]。非程序性死亡主要指細胞壞死。

細胞焦亡的信號通路主要分為經典通路和非經典通路，其中經典的細胞焦亡通路由Caspase-1介導，而非經典通路由Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介導。最初Hilbi[2]等于1997年發現在福氏志賀菌感染巨噬細胞后能引起Caspase-1依賴的程序性細胞死亡，觀察發現細胞腫脹的同時細胞膜發生破裂，使得胞內物質釋放進而引發炎性反應[3]，最終Cookson[4]于2001年將這種在巨噬細胞中發現的這種Caspase-1依賴的細胞死亡方式稱之為細胞焦亡(pyroptosis)。細胞焦亡的特征是質膜完整性的喪失和細胞內容物及炎癥因子(如IL-1β,IL-18等)的釋放，最終導致細胞破裂，釋放內容物，并導致天然免疫應答的進一步激活，引起一系列炎性反應[5]。

一、細胞焦亡與細胞凋亡的區別

細胞焦亡的形態學特點、發生及調控機理等均有別于凋亡等其他細胞死亡方式[6]。

1 細胞焦亡表現為明顯的DNA片段化,而細胞凋亡表現為核固縮和凋亡小體的形成。2 細胞焦亡過程中涉及的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶主要包括介導經典途徑的Caspase-1和非經典途徑的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11[7-9]，不伴有Caspase-3和ADP-ribose聚合酶(PARP)的活化[10]。3 細胞焦亡過程中，細胞膜發生破裂，釋放炎性介質，并引起炎性反應；而細胞凋亡過程中不涉及炎癥反應，且細胞膜保持完整。4 細胞焦亡依賴Caspase-1活性，抑制caspase-1可以阻止細胞焦亡，但不能阻止細胞發生凋亡或壞死[6]。

二、細胞焦亡激活的經典通路

細胞焦亡的經典通路是由Caspase-1介導，其關鍵步驟是炎性小體的組裝和Caspase-1的招募活化[11]，不僅存在于單核巨噬細胞系，還存在于樹突狀細胞、血管內皮細胞等其他細胞中[12-13]，參與機體的免疫反應。但Caspase-1依賴的細胞焦亡主要發生在巨噬細胞中，一個可能的解釋是巨噬細胞可能表達更高水平的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性[11]，其確定性仍需進一步的細胞水平的實驗證明。炎性小體是由多組蛋白質組成的復合物，主要包括模式識別受體(pattern recognitionreceptors，PRRs)、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated-speck-like protein containing a CARD，ASC)及Caspase-1前體(pro-caspase-1)[14]。其中PRR的NOD樣受體(NLR)可以識別PAMP和DAMP以啟動經典炎性體途徑，目前發現的有NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2等[15]。ASC 是一種接頭蛋白，主要由N端的PYD、C端的CARD組成，PYD和CARD是同源的蛋白間相互作用結構域，在ASC的寡聚化中起著類似橋梁的作用。pro-caspase-1是效應分子，其被活化后能夠特異性地作用于GSDMD蛋白。

炎性小體復合物的組裝始于PRRs識別特定的刺激，刺激的類型包括病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和宿主來源的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)。當特定刺激被識別后，PRRs發生寡聚化將N端的PYD結構域與ASC蛋白同源的PYD結構域相結合，ASC再通過CARD-CARD結構域的相互作用從而募集Caspase-1，完成炎性小體的組裝[16]。將Caspase-1前體(pro-Caspase-1)活化成caspase-1，后者一方面切割GSDMD蛋白，另一方面活化前體IL-1β、IL-18為有活性的IL-1β、IL-18，引起炎性物質釋放，引起細胞炎癥反應，這就是細胞焦亡的經典通路。

三、細胞焦亡激活的非經典通路

不依賴Caspase-1的焦亡被稱為非經典焦亡途徑[17-19]，細胞焦亡的非經典通路主要由Caspase-4和Caspase-5介導，在小鼠中為Caspase-11介導。細胞受到細菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)的刺激后，前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶直接與細菌脂多糖結合并被活化[20]，而不需要其他胞內受體(如NLRP3等)的介導。非經典通路中，前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的CARD直接與脂多糖的脂質A部分相互作用，引起前者顯著構象重排。這些原天冬氨酸蛋白酶的構象變化導致利用其CARD寡聚，從而使自身蛋白水解的活性受到限制。與經典通路相比，Caspase-11的寡聚直接涉及CARD，而Caspase-1的CARD用于ASC結合，而不是寡聚[21-22]。寡聚后，Caspase-11在D285后自動與MEAD/A序列一起水解GSDMD[23-24]，獲得了完全的蛋白水解活性。與裂解pro-IL-1β、IL-18和GSDMD的Caspase-1不同，活化的Caspase-4、5、11被認為只識別GSDMD，并在hGSDMD的D275或mGSDMD[23-24]的D276處切割，從而產生焦性孔隙，誘導細胞發生焦亡。

四、細胞焦亡的效應蛋白

Gasdermin D(GSDMD)位于8號染色體(8q24.3)，是由一個31 kDa的N端和一個22 kDa的C端通過肽鏈連接而成的蛋白質。2015年Shi J.等[23]研究發現DGSDMD是Caspase誘導細胞焦亡的最終效應蛋白，其可以被炎性Caspase激活，抑制GSDMD的C端結構域并釋放其N端結構域，后者具有膜磷脂上膜打孔活性，可與細胞膜磷脂酰肌醇結合形成孔洞(約10～16 nm)，破壞細胞膜完整性[25]，導致水分內流，細胞腫脹、破裂。另一方面可以激活無生物活性IL-1β和IL-18的前體，使其形成具有生物活性的IL-1β和IL-18并釋放至細胞外，募集炎癥細胞聚集，引起炎癥級聯反應[26]，誘導細胞焦亡的發生。此外，其他GSDM家族成員GSDMA3、GSDMA、GSDME等也具有類似的功能。

細胞焦亡與肺纖維化

肺纖維化是一種肺間質的慢性疾病，主要是由肺泡上皮損傷引起的細胞外基質膠原蛋白沉積，從而導致肺臟的不可逆性損傷的纖維化疾病[27]。組織學表現為程序性死亡，在較小程度上，壞死細胞夾雜著增生和不典型的2型上皮細胞[28]。臨床表現為進行性加重的呼吸困難及低氧血癥，發病率呈不斷上漲趨勢，嚴重影響人們的健康和生活質量。

研究顯示，炎性小體的啟動和激活可以使肺泡上皮細胞焦亡，并能進一步誘發炎癥反應及肺纖維化的進展[29]。在不同局部環境因素的刺激下，巨噬細胞可分為兩種不同的極化狀態：經典激活表型(M1)和交替激活表型(M2)[30]。在肺纖維化中，參與的巨噬細胞主要為M2型巨噬細胞。當外界或體內的刺激因子作用于肺細胞時，PRRs可識別刺激類型，聯合ASC與Caspase-1組成炎性小體，活化Caspase-1后?；罨腃aspase-1一方面切割GSDMD蛋白破壞肺細胞膜的完整性，另一方面使IL-1β和IL-18成熟與分泌，募集巨噬細胞等炎癥細胞聚集，產生級聯炎癥反應。其中裂解的巨噬細胞不僅促使IL-1、IL18等的分泌，還會導致M2巨噬細胞分泌的轉化生長因子-β(TGF-β)釋放，從而促進肺成纖維化細胞的增殖和分化及肺細胞的炎癥反正，參與肺纖維化的發生[31-32]。其中轉化生長因子-β1(TGF-β1)可以誘導炎癥反應，還可以促進肌成纖維細胞的聚集促進肺纖維化的發生。IL-18一方面參與肺纖維化的炎癥過程，另一方面還與肺組織損傷后的重建過程如肺間質纖維化、血管壁增厚和上皮細胞再生等有關，這些炎性因子的釋放表明細胞焦亡促進了肺纖維化的發生發展。

在博來霉素誘導的纖維化模型中，NLRP3缺陷小鼠支氣管肺泡灌洗液中表達水平與對照組相比，中性粒細胞流入減少，IL-1β水平降低，小鼠炎性反應減弱，炎性細胞及炎性因子較少，纖維化標志物(TIMP-1)的水平相應降低，表明博來霉素阻止肺纖維化的進展；；而普伐他汀可作用于P2X7受體，可增強炎性小體的活化，從而增加肺纖維化的風險[33-34]。Hussain[35]等研究發現多壁碳納米管(MWCNT)誘導初級人支氣管上皮(HBE)細胞焦亡，通過激活NLRP3炎性小體導致肺泡上皮細胞焦亡，來啟動肺纖維化進程。Pamela[36]等在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠中發現，NLRP3缺陷小鼠支氣管肺泡灌洗液中Caspase-1的激活、IL-1β生成均減少。孟瀟瀟等[37]通過實驗證明在百草枯中毒中，可能存在KCa3.1激活促使細胞內鉀離子外流，增高NEK7表達，進一步激活NLRP3炎癥小體，介導肺纖維化的發生。以上這些研究表明細胞焦亡通過炎性小體形成釋放炎性因子引起炎癥反應，促進肺纖維化的發生發展，表明調控炎性小體尤其是NLRP3的形成可能成為治療肺纖維化的一個突破點。但是對于其他的炎性小體的作用機制目前仍未完全明確，其在肺纖維化中的重要作用仍需進一步的積極探索。

細胞焦亡在肺纖維化治療中的進展

吡非尼酮和尼達尼布是近期批準用于治療肺纖維化的藥物，兩者均可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β等的分泌，抑制細胞焦亡的發生，減輕肺纖維化及肺部炎癥，前者在脂多糖誘導的模型中發揮重要作用[38]，后者則在聚六亞甲基胍磷酸(PHMG-P)誘導的模型中發揮重要作用[39]。Song等[40]通過實驗證明與吡非尼酮化學結構相似的氟苯尼酮可通過抑制NLRP3炎性小體的激活，降低Caspase-1和IL-1β水平，減輕肺纖維化。雖然目前的臨床藥物有效的改善了肺纖維化患者的生存率，但是其費用高、有一定的不良反應，也限制了這些藥物在臨床中的應用，因此繼續開發新的藥物是非常必要的。

王鵬飛[41]等通過動物實驗發現黃芪甲苷可以抑制Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達水平，抑制細胞焦亡過程，顯著改善了BLM誘導的小鼠肺纖維化。此外，通過細胞實驗證明，Caspase-1抑制劑YVAD具有緩解肺纖維化的能力，并可逆轉肺動脈高壓引起的肺纖維化[23, 42-43]。Tang等[44]發現虎杖苷在肺炎支原體感染的小鼠中可以逆轉肺炎支原體誘導小鼠體內的NLRP3炎癥體和NF-κB途徑的激活、Caspase-3表達、促纖維化相關蛋白TGF-SMA、膠原I和膠原Ⅲ的上調，抑制細胞焦亡從而改善肺纖維化，并抑制肺部炎癥，表明虎杖苷可以抑制肺纖維化的發生發展，作為肺纖維化潛在的治療藥物。一些植物中提取到的成分也被證明可以通過抑制細胞焦亡從而改善肺纖維化。實驗證明從石蒜科植物中提取的生物堿LYC可以靶向ASC和阻斷ASC與NLRP3的相互作用，減輕博來霉素誘導的肺纖維化的炎性小體激活和細胞焦亡，并且發現LYC能顯著降低Caspase-1的釋放和IL-1β的成熟形式[45]，以上研究表明LYC可能通過抑制細胞焦亡中NLRP3炎性小體活化而成為治療肺纖維化的潛在藥物。雖然LYC已經在國外被作為治療肺部急性炎癥的藥物，但是其在肺纖維化中的治療作用，仍需大量的研究驗證及臨床效果證明。Withaferin A(WA)是從睡蓮屬植物中分離得到的一種C5，C6-環氧甾體內酯。對照實驗表明WA治療的卵清蛋白誘導的肺纖維化小鼠體內I型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TIMP-1和波形蛋白的mRNA表達及TGF-β1、成纖維細胞活化與成纖維細胞特異性蛋白-1(FSP1)，纖連蛋白和波形蛋白等均減低，并且細胞焦亡相關的NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA水平也顯著降低，提示WA在肺纖維化及肺部炎癥的治療中有效[46]。流行病學調查顯示，含有聚六亞甲基胍磷酸(PHMG-P)的加濕器消毒劑導致肺損傷和呼吸衰竭，其特征是細支氣管閉塞和隨后的大量肺纖維化[47]。Kim等[48]實驗證明小豆中分離得到的齊墩果酸乙酸酯(OAA)通過降低PHMG-P處理的小鼠肺中NLRP3、ASC和Caspase-1的水平抑制肺纖維化進展。此外，一些研究發現干細胞也可通過抑制細胞焦亡抑制肺纖維化。Zhao等人[49]發現人類骨髓間充質干細胞通過其免疫抑制和抗纖維化功能保護肺免受肺纖維化的影響。月經血源性子宮內膜干細胞(MenSCs)的外體let-7可靶向LOX1調節NLRP3信號，從而抑制ROS激活和線粒體DNA損傷，MANSC分泌的外切體可能通過影響ROS的產生和mtDNA損傷而對肺纖維化和肺泡上皮細胞損傷起到保護作用[50]。此外，積雪草酸(Asiatic acid，AA)亦可以通過抑制炎性小體NLRP3的激活抑制細胞焦亡的發生，減輕肺纖維化[51]。細胞焦亡在肺纖維化中起重要作用，通過阻斷炎性小體的激活、Caspase-1、IL-1β和IL-18等因子的釋放，抑制細胞焦亡可能是改善肺纖維化患者預后的重要途徑，為肺纖維化的治療展開了新的方向。但是目前對于炎性小體的NLRP3的研究較為多見，其他炎性小體NLRP1、NLRC4、AIM2等在肺纖維化中的作用機制仍不明確，抑制NLRP3的同時是否抑制了細胞焦亡其他因子，及對其抑制作用程度是否相同，仍需通過相應的功能實驗及對照實驗證明。

小結

肺纖維化的發生發展是一個多因素共同作用的病理生理過程。細胞焦亡的激活可介導炎癥參與肺纖維化的發生發展的過程，而抑制Caspase-1、IL-1β和IL-18等細胞因子釋放，調控細胞焦亡通路的活化，繼而可以減輕肺組織炎癥，緩解肺纖維化的進展。但是仍有以下問題需要進一步的思考：(1)細胞焦亡與巨噬細胞尤其是M2型巨噬細胞的極化相應的信號通路及影響因素，可以通過構建細胞焦亡的纖維化模型進一步驗證巨噬細胞極化與細胞焦亡共同作用的因子；(2)炎性小體在肺泡上皮EMT的具體機制及誘發因素，可以在多種不同環境下構建肺纖維化動物模型進一步驗證EMT發生的不同速度；(3)是否細胞焦亡相關的其他因子也可以抑制肺泡上皮EMT，可以構建細胞焦亡的肺纖維化動物模型探討除了NLRP3外的其他細胞焦亡相關因子對肺細胞的作用；(4)抑制細胞焦亡的相關藥物是否可以作為肺纖維化的臨床用藥，可以通過構建藥物的動物模型探討其可能產生的毒副作用。因此鑒于細胞焦亡在肺纖維化的發病機理中具有廣泛而有效的作用，進一步研究細胞焦亡的確切機制為治療和診斷肺纖維化提供新的可能性和新的治療靶點是非常必要的。