外源花青素對干旱脅迫下烤煙幼苗生長及其生理特性的影響

莊 曄，劉瑞恒，付國占，王小東

(河南科技大學農學院/河南省旱地農業工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

水資源匱乏是威脅農業正常生產的主要因素之一，提高作物在缺水情況下生存和生長的能力至關重要。近年來，我國主要煙區旱情頻發，對烤煙生產帶來了巨大損失，干旱已成為我國烤煙生產優質穩產的重要限制因子之一[1]。干旱脅迫抑制植物細胞分裂[2]，導致植物體內活性氧的產生和清除系統之間的平衡遭到破壞[3]，使得活性氧過量積累，造成細胞內蛋白質與酶等生物大分子失活，細胞膜結構與功能遭到破壞[4]，光合作用受到抑制[5]，阻礙細胞正常代謝，最終導致作物減產降質，甚至死亡[6]。由于干旱對農業的威脅日趨嚴重，探究改善烤煙對干旱脅迫適應能力的新途徑及其調節機制具有重要的理論和實踐意義[7]。

當受到外部環境刺激時，植物可以通過自身內部生理活動進行調節，以應對外部環境變化對自身生長發育產生的影響，但是這種自身調節是有限的。施用外源物質是有效緩解植物干旱的重要途徑之一，前人研究了外源一氧化氮[8]、外源亞精胺[9]、外源硒[10]、外源褪黑素[11]等外源物質對烤煙在干旱條件下的緩解效應。當受到紫外線、鹽度或干旱脅迫時[12-14]，植物通常會積累與其應對壓力的能力相關的特殊代謝物，其中花青素是苯丙素途徑中研究最多的中間體[15]。有研究表明，花青素是當今人類發現最有效的抗氧化劑，也是最強效的自由基清除劑[16]。然而有關外源花青素對植物生理生化代謝調控的研究鮮有報道，為更好地了解外源花青素對植物生理和形態產生的影響及其對干旱脅迫耐受性，本試驗以‘秦煙96’和‘云煙116’為材料，研究外源花青素對烤煙幼苗農藝性狀、光合能力、活性氧系統的影響，進而明確外源花青素緩解烤煙幼苗干旱脅迫的適宜濃度及其調控機制，以期為減輕干旱脅迫對烤煙幼苗的抑制作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本試驗選用烤煙品種‘秦煙96’(以下簡稱Q96)和‘云煙116’(以下簡稱Y116)，前期已對兩個烤煙品種幼苗進行抗旱性評價，其中Q96較Y116的耐旱性更強。

試驗用塑料盆盆口和盆底直徑分別為40 cm和25 cm，盆高35 cm；供試土壤類型為褐土，質地為砂壤土，pH值7.55，有機質20.36 mg·kg-1，堿解氮66.53 mg·kg-1，速效磷15.86 mg·kg-1，速效鉀139.65 mg·kg-1。花青素由北京索萊寶生物科技有限公司提供。

1.2 試驗設計

盆栽試驗于2021年5月在河南科技大學農學院試驗大棚內進行。供試土壤過0.5 cm×1 cm網篩并風干，每盆裝風干土20 kg，供試肥料：硝酸磷肥(總氮32%、有效磷4%)、磷酸銨(全氮11%、有效磷44%)、硫酸鉀(50%)、餅肥(全氮5%)，施N量均為3.5 g·盆-1，其中N∶P2O5∶K2O為1∶1.5∶3，肥料混勻后一并裝入盆中。盆內安裝真空負壓計(Waterstar,北京)用于土壤水勢的監測，選取長勢一致的烤煙幼苗進行移栽(每盆1株煙苗)，兩個烤煙品種各設置7個處理(如表1所示)，每個處理重復3次，待還苗期結束(移栽5 d后)開始控水，并按照分組分別噴施0～5 mg·L-1的花青素(對照組噴施蒸餾水)，在煙葉正單面噴施均勻，每天7∶00—8∶00、11∶30—12∶30、16∶00—17∶00時記錄負壓計讀數，對負壓計讀數明顯變化的盆栽進行補水，于第15 d開始測定各處理烤煙幼苗的生長及生理指標。

表1 試驗處理設置情況Table 1 Test processing settings

控水可靠性驗證：在煙苗移栽前進行了控水處理預實驗，在預先裝好干土的盆內安放負壓計(每盆1支)，并設置了不同水分梯度，待負壓計讀數穩定后，采用環刀法測定盆內土壤的最大田間持水量，分別讀取每盆的負壓計讀數(即土壤水勢)和測得相應的土壤相對含水量。通過兩者相關分析表明，土壤相對含水量與土壤水勢(負壓計讀數)呈極顯著負相關關系，負壓計讀數能夠較好地指示土壤相對含水量。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生長指標 農藝性狀指標的選定參照煙草農藝性狀調查測量方法(中華人民共和國煙草行業標準YC/T 142-2010)；將植株樣品置于105℃下殺青30 min后經80℃烘干至恒重，稱量并計算其干物質積累量(即干重，以g為單位)。

PSⅡ最大光化學效率

(Fv/Fm)=(Fm-F0)/Fm

(1)

PSⅡ實際光化學效率

(2)

光化學猝滅系數

(3)

非光化學猝滅系數

(4)

1.3.3 活性氧系統相關指標 超氧陰離子自由基產生速率參照王愛國等的方法[17]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[18]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定[19]。

1.4 數據分析

采用Excel和SPSS統計軟件進行數據處理和分析；采用單因素方差分析和LSD檢驗同一品種內不同水分處理間的差異顯著性，采用F檢驗分析相同水分處理下不同品種間差異顯著性；采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源花青素對干旱脅迫下烤煙幼苗生長的影響

由圖1可知，干旱脅迫下兩個烤煙品種幼苗的株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬、最大葉面積和單株干重均顯著降低。與T0相比，當噴施外源花青素時，兩個烤煙品種幼苗的株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬、最大葉面積和單株干重均顯著增加，且隨著外源花青素濃度增加均呈現先增加后降低趨勢。與T0相比，T3處理Q96恢復效果最好，其株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬、最大葉面積和單株干重分別增加了23.1%、19.5%、43.0%、40.0%、100.2%和65.2%；T4處理Y116恢復效果最好，其株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬、最大葉面積和單株干重分別增加了32.6%、29.9%、51.3%、66.5%、151.8%和108.7%。在充足供水時，Q96的單株干重顯著低于Y116，在單純干旱脅迫下，Q96的單株干重顯著高于Y116，說明干旱對Y116單株干重影響較大；在T3處理下Q96的單株干重顯著高于Y116，說明3 mg·L-1外源花青素對Q96促進效果明顯；在T4處理下Q96的單株干重顯著低于Y116，4 mg·L-1外源花青素對Y116單株干重增加更明顯。

注：不同小寫字母表示相同品種不同處理間差異顯著(P<0.05)。在相同處理不同品種間，**表示相同處理兩個品種間差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)，ns表示差異不顯著(P>0.05)。下同。Note:Different lowercase letters indicate that there are significant differences among different treatments of the same variety(P<0.05).1n same treatment between different species,** indicates that the difference between two varieties in the same treatment is extremely significant,P<0.01;* indicates significant difference at P<0.05;ns indicates no significant correlation at P>0.05.The same as following.圖1 外源花青素對烤煙幼苗農藝性狀和單株干重的影響Fig.1 Effects of exogenous anthocyanins on agronomic characters and dry weight of flue-cured tobacco seedlings

2.2 外源花青素對干旱脅迫下烤煙幼苗光合特性的影響

由圖2可知，干旱脅迫下，兩個烤煙品種幼苗的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導度(Gs)均顯著降低，胞間CO2濃度(Ci)均顯著升高。與T0相比，噴施外源花青素處理中，兩個烤煙品種幼苗的Pn、Tr和Gs均顯著升高，Ci均顯著降低，且隨著外源花青素濃度的增加，Pn、Tr和Gs均呈現先升高再降低趨勢，Ci均呈現先降低再升高趨勢。與T0相比，T3處理Q96光合參數恢復最好，Pn、Tr和Gs分別增加71.2%、52.5%和44.8%，Ci降低24.3%；T4處理Y116光合參數恢復最好，Pn、Tr和Gs分別增加96.0%、85.3%和58.4%，Ci降低38.4%。在充足供水時Q96的Pn、Tr和Ci與Y116無顯著差異，在單純干旱脅迫下Q96的Pn和Tr均顯著高于Y116，Ci顯著低于Y116，說明干旱對Y116光合參數影響較大；在T3處理下Q96的Pn和Tr均顯著高于Y116，Ci顯著低于Y116，說明3 mg·L-1外源花青素對Q96光合作用增強效果明顯；在T4處理下Q96的Pn和Tr均顯著低于Y116，Ci顯著高于Y116，說明4 mg·L-1外源花青素對Y116的光合作用提升更明顯。

2.3 外源花青素對干旱脅迫下烤煙幼苗葉綠素熒光特性的影響

干旱脅迫下兩個烤煙品種幼苗的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均顯著降低，NPQ均顯著升高(圖3)。與T0相比，噴施外源花青素處理中，兩個烤煙品種幼苗的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均顯著升高，NPQ均顯著降低，且隨著外源花青素濃度的增加，Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均呈現先升高再降低趨勢，NPQ均先降低再升高。與T0相比，T3處理Q96葉綠素熒光恢復最好，Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP分別增加71.2%、52.5%和44.8%，NPQ降低24.3%；T4處理Y116光合參數恢復最好，Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP分別增加96.0%、85.3%和58.4%，NPQ降低38.4%。在充足供水時Q96的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均與Y116無顯著差異，在單純干旱脅迫下Q96的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均顯著高于Y116，說明干旱對Y116葉綠素熒光特性影響較大；在T3處理下Q96的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均顯著高于Y116，3 mg·L-1外源花青素對Q96的葉綠素熒光特性提升效果明顯；在T4處理下Q96的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均顯著低于Y116，4 mg·L-1外源花青素對Y116的葉綠素熒光特性提升更明顯。

圖2 外源花青素對烤煙幼苗光合特性的影響Fig.2 Effects of exogenous anthocyanins on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco seedlings

2.4 外源花青素對干旱脅迫下烤煙幼苗超氧陰離子自由基產生速率的影響

圖3 外源花青素對烤煙幼苗葉綠素熒光特性的影響Fig.3 Effects of exogenous anthocyanins on chlorophyll fluorescence characteristics of flue-cured tobacco seedlings

2.5 外源花青素對干旱脅迫下烤煙幼苗MDA含量的影響

圖5 外源花青素對烤煙幼苗MDA含量的影響Fig.5 Effect of exogenous anthocyanin on MDA content of flue-cured tobacco seedlings

由圖5可知，干旱脅迫下兩個烤煙品種幼苗的MDA含量均顯著升高。與T0相比，噴施外源花青素處理中，兩個烤煙品種幼苗的MDA含量均顯著降低，且隨著外源花青素濃度的增加呈現先降低再升高趨勢。與T0相比，T3處理Q96的MDA含量下降幅度最大(26.3%)；T4處理Y116的MDA含量下降幅度最大(47.2%)。在充足供水時，Q96的MDA含量顯著高于Y116，在單純干旱脅迫下Q96的MDA含量顯著低于Y116，說明干旱脅迫下Y116的MDA增量較大；在T3處理下Q96的MDA含量顯著低Y116，說明3 mg·L-1外源花青素下Q96的MDA含量降低效果最明顯；在T4處理下Q96的MDA含量顯著高于Y116，說明4 mg·L-1外源花青素對Y116的MDA含量降低效果最明顯。

2.6 外源花青素對干旱脅迫下烤煙幼苗抗氧化酶活性的影響

圖6 外源花青素對烤煙幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of exogenous anthocyanin on antioxidant enzyme activity of flue-cured tobacco seedlings

由圖6可知，干旱脅迫下Q96的SOD活性升高，POD和CAT活性顯著升高；Y116的SOD、POD和CAT活性顯著降低。與T0相比，噴施外源花青素處理中，兩個烤煙品種幼苗SOD、POD和CAT活性均顯著升高，且隨著外源花青素濃度的增加，SOD、POD和CAT活性均呈現先升高再降低趨勢。與T0相比，T3處理Q96的SOD、POD和CAT活性達到最高，分別增加48.3%、43.1%和31.3%；T4處理Y116的SOD、POD和CAT活性達到最高，分別增加64.6%、74.9%和29.7%。在充足供水時，Q96的SOD、POD和CAT活性均低于Y116，在單純干旱脅迫下Q96的SOD、POD和CAT活性均高于Y116，說明干旱脅迫下Q96的抗氧化能力較強；在T3處理下Q96的SOD、POD和CAT活性均高于Y116，說明3 mg·L-1外源花青素對Q96的抗氧化能力提升效果明顯；在T4處理下Q96的SOD和POD活性均顯著低于Y116，說明4 mg·L-1外源花青素對Y116的抗氧化能力提升更明顯。

3 討論與結論

干旱脅迫嚴重限制植物的正常生長發育，主要是因為干旱脅迫限制了植物的光合作用，活性氧系統平衡遭到破壞等多方面生理功能下降[20]。本試驗中隨著干旱程度的加劇，兩個烤煙品種的生長均受到阻礙，耐旱型烤煙品種Q96能通過自身調節快速適應干旱環境，自身生長受到的限制較小。葉片噴施外源花青素處理中，兩個烤煙品種的生長狀況明顯優于單純干旱處理，這與許靈杰等[21]的研究結果一致，這是因為外源花青素增強了烤煙幼苗在干旱脅迫下的光合能力，使其生長受干旱脅迫的限制變小，而兩個烤煙品種的最適的外源花青素濃度不一致，這可能與品種自身的耐旱性有關。

逆境脅迫抑制光合作用的原因可以分為氣孔限制和非氣孔限制，當受到水分脅迫時，保護氣孔細胞水勢下降，致使作物葉片氣孔關閉，阻礙作物對CO2的吸收利用，此時光合作用減弱是氣孔限制因素；當作物遭受干旱脅迫時，氣孔部分或全部關閉，葉片組織內CO2濃度升高，葉綠體結構受損，導致類囊體膜的解體和光系統Ⅱ(PSⅡ)功能遭到破壞，葉肉細胞光合性能降低，此時光合作用下降是由非氣孔因素引起的[23]。本試驗表明，干旱脅迫下兩個烤煙品種的Pn、Tr和Gs均下降，與楊文權等[24]在烤煙干旱脅迫上的研究結果和賴金莉等[25]在鼓節竹干旱脅迫研究結果一致，說明烤煙幼苗光合速率的下降是由非氣孔因素導致的。噴施外源花青素處理中，兩個烤煙品種的Tr、Pn和Gs均顯著升高，而Ci均顯著降低，這與李敏敏等[26]在葡萄砧木葉片緩解干旱脅迫措施方面的研究結果一致，說明烤煙幼苗噴施適宜濃度的外源花青素可以增強烤煙幼苗對光能的轉化進而提高光合性能。

葉綠素熒光參數能夠真實反映葉片對光能的吸收、傳遞、轉換和耗散情況[27]。在干旱脅迫下，烤煙葉片Fv/Fm和qP降低，是因為植物PSII反應中心受損，導致PSII反應中心的光化學活性降低，降低了光能轉化效率，光合作用被限制，此時植物會激發自身保護機構，通過提高NPQ及時耗散過剩的光能起到保護光合機構的作用[28]。本試驗表明，干旱脅迫下兩個烤煙品種的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP均顯著下降、NPQ均顯著上升，這與張會慧等[29]在干旱脅迫下外源鈣緩解烤煙PSII方面的研究結果一致。在干旱脅迫下噴施不同濃度的外源花青素，兩個烤煙品種幼苗的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP明顯上升、NPQ明顯下降，這與劉領等[30]在外源褪黑素緩解烤煙干旱脅迫方面的研究結果一致，說明噴施適宜濃度的外源花青素對干旱脅迫下PSⅡ反應中心起到保護作用，并有效增加光合電子傳遞，減輕光抑制作用，保護光合機構。

逆境環境下植物體內活性氧(ROS)代謝平衡受到破壞，導致ROS過量積累，造成膜脂過氧化，使細胞膜的正常功能受損[31]，形成過氧化產物MDA，MDA含量受脅迫程度和脅迫時間的影響，干旱程度越高、時間越長，MDA含量則越高[32]?？寡趸甘侵参锛毎钟钚匝鮽Φ闹匾Ｗo酶[33]，當植物遭受逆境脅迫時，通過調節自身抗氧化酶活性清除體內產生的過多自由基以起到自我保護的作用。本試驗表明，干旱脅迫下兩個烤煙品種幼苗的超氧陰離子自由基產生速率加快，MDA含量上升，這與李冬等[34]的研究結果一致，耐旱型烤煙品種的抗氧化酶活性增加，這與王發展等[35]在烤煙干旱脅迫方面的研究結果一致，說明抗旱性強的品種可能會通過激發抗氧化酶基因，增強自身的抗氧化能力；而抗旱性弱的品種因調節能力不足，氧化損傷嚴重，抑制抗氧化性能的發揮，導致抗氧化酶活性下降。干旱脅迫下施用不同濃度的外源花青素能有效降低超氧陰離子自由基的產生速率，抑制MDA的產生，提高抗氧化酶活性，這與梁太波等[36]在外源甜菜堿和脯氨酸增強烤煙干旱脅迫下抗氧化代謝方面的研究結果一致，說明干旱脅迫下適宜濃度的外源花青素能夠修復活性氧系統的平衡，提升抗氧化酶活性，清除過量活性氧，增加烤煙幼苗的抗逆性。

干旱脅迫對不同烤煙品種的影響存在一定差異，本試驗在盆栽條件下研究了在干旱脅迫下噴施外源花青素對兩種不同耐旱性烤煙品種幼苗生長和生理特性的影響，外源花青素和植物激素之間可能的串擾可能在植物的干旱脅迫耐受性中起著至關重要的作用，外源花青素在干旱脅迫期間發揮作用的復雜分子系統需要進一步深入研究。