22種中藥多糖對豬源大腸桿菌的體外抑菌活性研究

尹 苗，周艷美，陳希文*，王 聰，吳 倩，趙 洪

(1.綿陽師范學院動物疫病防控與健康養殖工程技術研究中心，四川綿陽 621000；2.四川生豬重大疫病監測與防控工程研究中心，四川綿陽 621000)

0 引言

大腸桿菌病是嚴重危害當前畜禽業健康發展的細菌病之一，可以引起仔豬黃白痢和水腫病等，長期以來其防治主要依靠抗生素.但由于大腸桿菌易產生耐藥性，其耐藥質粒也能夠在人和動物之間傳播，給人類健康和公共衛生安全造成了嚴重危害[1].同時，近年來超級大腸桿菌和多重耐藥菌株的出現，引起了世界的廣泛關注，多國紛紛制定政策禁止在養殖過程中長期使用抗生素.根據2019年7月9日農業農村部第194號公告部署，從2020年7月起停止生產、進口加工和使用部分藥物為飼料添加劑，以維護動物源食品安全和公共衛生安全[2].因此，尋找抗生素替代品保障畜牧業健康持續發展已迫在眉睫.中藥因其具有營養、保健、促生長以及無殘留和不易產生耐藥性等特點，已逐漸被國內外研究者重視，研究發現中藥及中藥提取物對很多致病菌具有較強的抑制作用，有望成為抗生素的替代藥物或輔助藥物[3-5].同時，隨著社會對食品安全及無抗養殖的重視和關注，篩選對致病菌敏感、高效、低毒和低殘留的中藥來防控動物疾病已經成為當前獸醫工作者研究的熱點和趨勢，也是發展綠色健康高效無抗養殖急需解決的一個重要課題.本研究選擇多糖含量較高的22種中藥，采用超聲波輔助法提取其多糖化合物，研究其對豬源大腸桿菌的體外抑菌活性，以期為獸醫臨床合理用藥、有效防控大腸桿菌病提供科學依據.

1材料與方法

1.1 中藥材

22種常用中藥材地榆、黃芪、大黃、虎杖、丹參、黃連、柴胡、魚腥草、黨參、何首烏、茜草、川牛膝、甘草、石榴皮、黃芩、茯苓、苦參、枸杞、白術、升麻、大棗、山茱萸和蒲公英均購自綿陽天源堂大藥房.根據中藥復方的組方原則[6]，選擇單味抑菌活性較好的中藥輔以補益理氣等藥物，組成9個復方，如下：

復方1：大黃5+虎杖5/g；

復方2：黃芩2.5+地榆2.5+大黃2.5+虎杖2.5/g；

復方3：黃芩1.7+地榆1.7+大黃1.7+虎杖1.7+茯苓1.6+白術1.6/g；

復方4：黃芩2.5+金銀花2.5+蒲公英2.5+紫花地丁2.5/g；

復方5：黃芩1.5+地榆1.5+大黃1.4+虎杖1.4+金銀花1.4+蒲公英1.4+紫花地丁1.4/g；

復方6：黃芩1.7+地榆1.7+大黃1.7+虎杖1.7+茯苓1.6+川牛膝1.6/g；

復方7：黃芩1.7+地榆1.7+大黃1.7+虎杖1.7+大青葉1.6+桔梗1.6/g；

復方8：黃芩1.5+地榆1.5+大黃1.4+虎杖1.4+丹參1.4+黃連1.4+黃芪1.4/g；

復方9：黃芩5+地榆5/g.

1.2 主要試劑及培養基

普通營養瓊脂和肉湯培養基等(購自北京奧博星生物技術有限責任公司)；微量生化發酵管(購自青島高科園海博生物技術有限公司)；正丁醇、無水乙醇和丙酮等常規藥品為化學純(購自綿陽市信捷商貿有限責任公司).

1.3 供試菌種

本試驗所用大腸桿菌菌株分離自綿陽市某規模化豬場腹瀉仔豬病料，由綿陽師范學院動物疫病防控與健康養殖工程技術研究中心鑒定保存.

1.4 中藥多糖的提取

將中藥用超聲波提取3次，濃縮至25 mL，按1∶3的比例加入95%的乙醇，靜置過夜，第2天以3 000 r/min離心20 min，除去上清液得到多糖沉淀，加入蒸餾水至恒定體積10 mL；加入Sevage試劑(正丁醇：氯仿=4∶1，Sevage：濾液=1∶5)，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，重復兩次，以有效去除蛋白質等雜質，至恒定體積為10 mL.具體方法參照參考文獻[7].所有藥液在立式壓力蒸汽滅菌器中121 ℃下滅菌15 min，然后在4 ℃冰箱中保存備用.

1.5 菌懸液的制備

將保存的豬源大腸桿菌在無菌條件下活化后，接種于普通瓊脂斜面培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h，每支斜面加入1.5 mL滅菌蒸餾水，洗凈菌液，將細菌濃度調至1.5×106CFU/mL備用.具體方法參考文獻[8].

1.6 體外抑菌活性的測定

采用牛津杯法，將滅菌后的液體培養基倒入平板內，待其凝固后，用微量移液器吸取0.1 mL菌懸液，涂布器涂抹均勻，再等距離放入4個牛津杯，用微量加樣器吸入含生藥1 g/mL的中藥多糖溶液0.2 mL于對應牛津杯中，置37 ℃條件下，恒溫培養18～24 h，測量抑菌圈直徑.

1.7 最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用二倍稀釋法，每11根試管為一組，重復3次.首先加入2 mL無菌營養肉湯到11支試管中，在1號試管中加入2 mL含1 g/mL的中藥多糖溶液吹打混勻，再按照2倍稀釋法以此類推，直到第9號試管.此時，試管1～9的混合溶液中藥提取物的濃度分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9和0.9 mg/mL，試管10作為陽性對照，試管11作為陰性對照，觀察是否有細菌感染.用微吸管將0.1 mL稀釋后的菌懸液吸入試管1～9中，37 ℃孵育18～24 h.觀察透明和不渾濁的試管，選擇濃度最低的試管溶液，即藥物對細菌的最低抑制濃度(MIC).

1.8 最低殺菌濃度(MBC)的測定

將上述選出的透明無渾濁試管，吸取溶液0.1 mL加入培養基中，置于37 ℃恒溫養24 h.以99.9%殺死試驗菌菌體的藥物最高稀釋度，為最低殺菌濃度(MBC).

2 結果與分析

2.1 單味中藥多糖的抑菌活性

實驗結果表明，22種中藥多糖的初提物對豬源大腸桿菌的抑菌效果存在較大差異，其中黃芩和地榆的體外抑菌活性最強，抑菌圈直徑分別為22.3 mm和21.6 mm，MIC和MBC均為7.8 mg/mL，其次是大黃、虎杖、何首烏、黃芪、石榴皮、柴胡、升麻、甘草、山茱萸等中藥，其抑菌圈直徑均在15 mm以上，也具有較強的抑菌活性.而大棗、黨參和大葉茜草三種中藥對豬源大腸桿菌沒有明顯的抑菌效果，見表1.

表1 22味中藥對豬源致病性大腸桿菌抑菌結果Tab.1 Antibacterial effect of 22 traditional Chinese medicines on pathogenicEscherichia Colifrom pigs

2.2 復方中藥多糖的抑菌活性

9個復方多糖初提物體外抑菌實驗結果表明，復方1、復方3、復方6和復方7對豬源性大腸桿菌為極敏感；復方2、復方5、復方8和復方9均出現抗菌能力降低的現象.其中復方3和復方7對豬源大腸桿菌菌的抑菌圈直徑分別為27.4 mm、26.5 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL與單方中抑菌活性最強的黃芩和地榆比抑菌圈明顯增大，MIC和MBC均有降低.見表2.

3 結論與討論

大腸桿菌普遍存在于人和動物的腸道內，危害性大、流行范圍廣，且發病率和死亡率高，導致畜禽生長緩慢，料肉比低下，給養殖戶帶來巨大的經濟損失.同時血清型多，免疫效果不明顯，一直依賴抗菌藥物防治，抗生素過量使用導致的藥殘、耐藥性等一系列的危害有目共睹.在中獸醫學中中藥作為重要組成部位，在臨床實踐中已運用數10年.本試驗選取的22味中藥具有活血化瘀、消癰散結、清熱解毒和祛濕等功效，且其中大多數中藥對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有很好的殺菌抑菌效果.其中黃芩、地榆屬于清熱燥濕解毒類中藥對大腸桿菌的MIC和MBC均為7.8 mg/mL；大黃和虎杖次之，MIC為15.6 mg/mL；大棗、黨參和大葉茜草沒有表現出抑菌效果.劉小鳳[9]等研究顯示，黃芩對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌作用最強，這與本實驗結果相符；羅怡琳[10]等研究顯示，大黃等對臨床大腸桿菌沒有抑菌作用，這與本試驗結果不一致；張凱睿[11]等用地榆提取物對大腸桿菌抑菌活性試驗顯示，地榆正丁醇提取物對大腸桿菌的MIC為3.125 mg/mL，說明地榆對大腸桿菌作用強，此結果與本實驗結果一致.本研究發現在中藥實際應用中，用量及用法比西藥要復雜且量大，臨床推廣受到很大限制，也會由于提取方法等不同，效果也不同，在眾多研究結果中存在一定差異.筆者認為這有可能與中藥種類、提取方法、試驗條件及大腸桿菌血清型不同等相關；還有可能與中藥對機體作用靶點較多，在抑菌的同時還有抗炎、抗氧化和增強免疫力等功效有關.具體的作用機制和用藥情況還需進一步深入研究.中藥講究君君臣臣，七情配伍，本試驗中，復方3和復方7聯合用藥時，對豬源性大腸桿菌呈現協同作用，且MIC為3.9 mg/mL，抑菌效果呈相加效果，可以理解為中藥中的相須配伍；復方2、復方5、復方8和復方9聯合用藥時，抑菌效果反倒降低呈無關作用，或可單獨用藥更好.在戴悅[12]等研究報道得出，復方中藥的不同配伍對大腸桿菌呈不同的敏感度，單方的抑菌效果不一定比復方差.所以，在臨床用藥需根據實際情況，辯證用藥.