大皰性表皮松解癥及其分子治療研究進展

李杏杏，孔姝敏，曹育春，孫小燕

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院皮膚科，湖北 武漢 430030）

大皰性表皮松解癥（Epidermolysis bullosa，EB）一般指遺傳性大皰性表皮松解癥，是一種以常染色體顯性或隱性方式遺傳的皮膚病。EB的臨床特點是輕微創(chuàng)傷或摩擦后皮膚黏膜即可出現(xiàn)水皰、糜爛或潰瘍［1，2］。大多數(shù)EB患者可伴發(fā)瘙癢，不同亞型之間瘙癢發(fā)生率存在顯著差異［3］。EB的臨床表現(xiàn)并不局限于皮膚和黏膜，常伴有全身并發(fā)癥，包括營養(yǎng)不良、微量元素缺乏、貧血、慢性炎癥、感染、繼發(fā)皮膚鱗癌等［4］。本文大致概述了EB的分子病理學機制、臨床分型和基因突變特點，主要闡述了基因治療、細胞療法、蛋白質療法和小分子藥物治療等EB最新的分子治療進展。

1 EB的分子病理學機制

皮膚是人體最大的器官，由皮下組織、真皮及覆蓋在上的表皮層組成。表皮基底層和真皮乳頭層之間由細胞外基質大分子物質將表皮與真皮緊密連接，稱基底膜帶（basement membrane zone，BMZ）。BMZ不僅提供了細胞黏附的支架，還為細胞遷移提供了條件，為細胞和分子提供了選擇性通透屏障，可調節(jié)被覆上皮細胞的分化、發(fā)育和死亡。電鏡下BMZ由淺至深為胞膜層、透明層、致密層及致密下層，這個區(qū)域是EB病理生理中心位置。在胞膜層，半橋粒借助附著斑與胞質內張力細絲相連，同時通過多種跨膜蛋白如BPAG2、整合素α6β4等與下方透明層黏附，起“鉚釘”樣作用。在下方，錨絲、Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原即錨原纖維相互交聯(lián)，具有連接和固定作用，是BMZ重要支撐結構［5］。EB的臨床表現(xiàn)取決于特定基因的分子畸變及影響皮膚黏膜脆性超微結構的異常平面位置。目前已發(fā)現(xiàn)19個基因的致病變異與EB相關，包 括COL17A、KRT5、KRT14、LAMA3、LAMB3、LAMC2、ITGB4、ITGA3等［6，7］。這些基因編碼突變影響上述結構的相應功能及穩(wěn)定表達，導致皮膚脆性增加，引起EB的典型臨床表現(xiàn)。上述受影響基因和蛋白種類及其致病遺傳變異的具體性質一定程度上決定了EB的表型。具體來說，受影響蛋白殘余量或殘余功能多少，決定了疾病嚴重程度是輕度、中度還是重度［8，9］。

2 EB的主要臨床亞型

根據(jù)超微結構中結構脆性和水皰形成的平面位置不同，EB可分為如下四種類型，而各類型又可分為不同的亞型，有不同的遺傳方式和致病分子。

2.1 單純型大皰性表皮松解癥（Epidermolysis Bullosa simplex，EBS） EBS是EB中最常見的類型，多為常染色體顯性遺傳，也有一些罕見的常染色體隱性遺傳。該型臨床表現(xiàn)較輕，偶有重度泛發(fā)性EBS的病例報道［10］。大多數(shù)EBS是由編碼角蛋白5和角蛋白14的KRT5或KRT14基因顯性突變引起的。該突變導致基底層角質形成細胞的中間角蛋白絲網絡缺陷，引起表皮內的分裂［11，12］。EBS患者的發(fā)病年齡不定，其皮損如糜爛和水皰等愈合后基本不遺留疤痕，皮膚癥狀大多隨著年齡的增長而改善。而重度泛發(fā)性EBS經常伴隨出現(xiàn)疼痛性掌跖角化病和甲營養(yǎng)不良［4］。

2.2 營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥（Dystrophic Epidermolysis Bullosa，DEB） DEB是EB中第二常見的類型，為常染色體顯性或隱性遺傳。DEB是由于COL7A1基因突變，無法正常編碼VII型膠原（C7），在基底膜致密下層發(fā)生相應病變［15］。DEB臨床表現(xiàn)具有廣泛變異性，無論是自發(fā)或輕微創(chuàng)傷均可引起表皮脫落、水皰和粟丘疹形成。所有粘膜包括口腔，食管，眼部，生殖器，肛門等，均可受到影響，并伴有全身并發(fā)癥。瘙癢是DEB的一個主要并發(fā)癥，在即將愈合的皮損處尤甚，由此引起的搔抓是一個重要的加重病情的行為因素。其中，隱性遺傳型DEB（RDEB）能夠導致嚴重的局部或全身并發(fā)癥。局部并發(fā)癥包括慢性復發(fā)性皮損處傷口、假性并指、食管狹窄、結膜潰瘍、疼痛性角膜糜爛和瞼球粘連等。全身性并發(fā)癥包括營養(yǎng)不良、貧血、全身性感染、腎淀粉樣變性和骨質疏松等。其他DEB亞型包括中間型、反相型、局限性、癢疹型等，癥狀相比而言較輕［1］。慢性創(chuàng)面進展為侵襲性皮膚癌如皮膚鱗狀細胞癌是DEB患者死亡的主要原因，有數(shù)據(jù)認為超過50%的DEB患者在40歲之前死于轉移性鱗狀細胞癌［16］。

2.3 交界型大皰性表皮松解癥（Junctional Epidermolysis Bullosa，JEB） JEB據(jù)報道是EB中最少見的類型［10］，主要為常染色體隱性遺傳，顯性遺傳較為罕見。突變涉及半橋粒組成成分的編碼基因，如層粘連蛋白332、XVII型膠原、整合素α6β4和整合素α3β1［13］。JEB包含兩個主要亞型，即重度型和中度型，兩者的疾病嚴重程度有相當大的差異。重度型JEB臨床特征表現(xiàn)為皮膚和粘膜多發(fā)廣泛性大皰性脫落，常累及呼吸道，嬰幼兒患者早期死亡率較高。中度JEB皮膚黏膜受累程度較輕，對預期壽命影響不大，常伴隨甲營養(yǎng)不良或甲缺失伴甲周水皰［4，14］。

2.4 Kindler大皰性表皮松解癥（Kindler Epidermolysis Bullosa，KEB） KEB以前被稱為Kindler綜合征，最近被歸類為EB的新亞型。kindlin是一類參與構成基底層角質形成細胞接觸中心的蛋白，KEB與編碼該蛋白的FERMT1基因隱性突變有關。該型分裂水平多重，可以發(fā)生在角質形成細胞內，也可以在致密層或致密層以下，且與基底層角質形成細胞的復制異常有關。患者臨床表現(xiàn)包括皮膚脆性增加、大皰、光敏、進行性皮膚異色癥、明顯皮膚萎縮和牙周病等［17］。

3 EB的分子治療

EB分子治療在過去幾十年里不斷發(fā)展，已經開展了大量的臨床前研究［18，19］。目前大多數(shù)治療方法都旨在通過基因、細胞治療或蛋白質替代療法來恢復缺陷結構蛋白的功能。但EB并不局限于皮膚損害，恢復皮膚蛋白功能的治療可能無法解決EB相關的所有局部和全身并發(fā)癥。因此，如皮膚炎癥、纖維化、瘙癢、疼痛或癌癥的治療方法也正在研究當中。

3.1 細胞療法 間充質干細胞是一種多能性間充質細胞，可分化為多種細胞類型，包括成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞。其具有抗炎、血管生成、抗纖維化和組織修復等特性，有助于改善EB的傷口愈合。Palison［20］團隊在智利開展了一項臨床研究，即對兩名重型泛發(fā)性RDEB成年患者皮損內注射健康同種異體骨髓基質干細胞，治療慢性皮膚潰瘍。與一般藥物相比，實驗組皮損的臨床改善持續(xù)時間長達4個月，局部炎癥減少，傷口愈合更快。

成纖維細胞由于能夠產生C7并具有免疫調節(jié)特性，易于培養(yǎng)，已成為RDEB細胞治療研究新方向［21，22］。早期臨床前研究表明，皮內注射正常的人類成纖維細胞或基因修正后的RDEB成纖維細胞到免疫缺陷小鼠皮膚，有助于C7的重新表達及錨原纖維的再形成，并促進注射部位的傷口愈合［23-25］。McGrath及其同事［26］在5例RDEB患者皮膚內注射同種異體健康人成纖維細胞，其臨床試驗結果顯示，注射后2周和3個月時測得真皮表皮連接處C7表達增加，傷口愈合改善。

3.2 基因替代療法 1998年，Dellambra等［27］人證明了可以使用攜帶LAMB3 cDNA的經典逆轉錄病毒載體對JEB角質形成細胞進行體內校正。同樣，Goto［22］和Siprashvili［28］等人使用經典逆轉錄病毒載體將轉基因導入體外培養(yǎng)的JEB角質形成細胞，隨后將矯正后的細胞移植到免疫缺陷小鼠上，結果顯示有錨原纖維形成。之后，不少研究證明將基因矯正后的患者上皮移植回缺陷皮膚后，其皮損處有錨原纖維的重新形成，實現(xiàn)了一定程度的功能矯正［29，30］。這些臨床前研究已初步證明了體外基因治療的潛力。在這些試點研究之后，Holostem發(fā)起了兩項I/II期臨床試驗，即對12名攜帶COL17A1突變的JEB患者（NCT03490331）和12名RDEB患者（NCT02984085）移植基因矯正上皮，評估療效。

另一種方式是將cDNA通過嗜表皮性HSV或非病毒載體直接傳遞到皮膚中。例如，Krystal在4例RDEB患者中進行了一項II期試驗（NCT03536143），將含有HSV-1載體和強CMV啟動子表達的COL7A1 cDNA直接轉染到皮膚細胞。這種體內基因治療耐受良好，重復給藥不會引起局部炎癥，且最終數(shù)據(jù)顯示，在第8至12周期間，患者傷口面積顯著減少，愈合能力增強。

3.3 基因編輯療法 除了基因替代療法，一些研究還試圖進行基因修復，如通過CRISPR/Cas9基因編輯技術校正突變［31-35］。CRISPR/Cas9以特定的方式誘導DNA雙鏈斷裂，通過同源定向修復、非同源末端連接或DNA修復，糾正疾病相關基因突變［36］。既往研究中，來自RDEB患者的角質形成細胞或成纖維細胞通過該技術獲得了高產量的基因修正，隨后對免疫缺陷小鼠進行皮膚移植，證明了其具有合成功能性C7的能力。CRISPR/ Cas9基因編輯可以精準、永久性地糾正致病突變，恢復基因的生理表達和功能。但它的潛在限制是需要大量培養(yǎng)細胞來生產移植物，效率較為低下，需要更深入、更成熟的技術研究進行完善和改進［37，38］。

3.4 逆轉突變細胞療法 回復鑲嵌現(xiàn)象（Revertant mosaicism，RM）是由于自發(fā)性或繼發(fā)性體細胞突變，通過恢復缺陷蛋白的表達來補償遺傳突變和恢復表型的現(xiàn)象，十分罕見。RM為EB細胞基礎治療提供了一種“自然基因治療”的可能性。在這種情況下，一些皮膚細胞會自發(fā)地將突變逆轉為野生基因型，從而形成正常皮膚區(qū)域［39，40］。EB中首次發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象是在JEB患者中，其角質形成細胞干細胞發(fā)生體細胞逆轉突變后出現(xiàn)健康皮膚補丁［39］。后來在EBS、RDEB和KEB患者的角質形成細胞中進一步證實了RM的存在［40，41］。Matsumura等［42］人進行了一項臨床試驗，使用從完整皮膚補丁中提取的退化角質形成細胞自體移植治療3例嚴重DEB和不愈合潰瘍患者（UMIN：000020734），從非病變皮膚中分離并在體外擴增逆轉角質形成細胞，培養(yǎng)自體上皮，然后移植到慢性潰瘍上。盡管該現(xiàn)象較為罕見，但該治療方法能夠長期糾正基因缺陷，可能是一種更安全的基因治療。

3.5 外顯子跳躍療法 外顯子跳躍是利用反義寡核苷酸（ASOs）來修飾前信使RNA的剪接，使其不能被正常識別，導致目標突變外顯子的切除，從而消除導致疾病的突變。一些臨床前研究表明，COL7A1中外顯子13、70、73、80或105的跳躍剪接能夠導致部分功能蛋白在真皮-表皮連接區(qū)重新沉積［43-46］。ASO介導的外顯子跳躍療法可以恢復RDEB皮膚異種移植中C7表達和錨原纖維的形成，其密度與正常皮膚相似［43］。目前，一項將一種包含ASO靶向外顯子73的水凝膠QR-313，直接局部應用于DEB創(chuàng)面，用于COL7A1矯正的臨床試驗（NCT03605069）正在進行中。體內ASO介導外顯子跳躍治療的優(yōu)點在于它們是非免疫原性的，可以局部或系統(tǒng)給藥，并保留基因的生理調節(jié)。但其治療需持續(xù)終身，只適用于一部分患者。

3.6 蛋白質療法 臨床前研究表明，局部或靜脈注射的重組C7可以沉積在真皮-表皮連接區(qū)，并促進傷口愈合［47，48］。系統(tǒng)給藥重組C7蛋白除了可以靶向到皮膚中，還可以到達受RDEB影響的皮膚外組織，如胃腸道黏膜和眼角膜并進行修復。重組C7已獲得美國FDA的快速藥物認證，且正在進行一項I/II期臨床試驗，評估其安全性和耐受性以及在成人RDEB患者中的臨床應用（NCT03752905）。中期數(shù)據(jù)表明，重組C7在所有患者中均有良好的耐受性，未出現(xiàn)任何嚴重不良反應，且在28天時三次輸注后C7的皮膚沉積呈劑量依賴性增加。

3.7 通讀療法 通讀療法是指使用小分子化合物將其氨基酸取代終止密碼子，抑制無義突變，使蛋白質正常合成。慶大霉素等氨基糖苷類藥物具有抑制無義突變導致的基因翻譯終止的能力，能夠恢復全長蛋白質的合成，已成為能夠治療人類遺傳疾病的藥物制劑。Woodley［49］和Chen［50］的實驗使用了來自數(shù)個出現(xiàn)無義突變的RDEB患者角質形成細胞和成纖維細胞培養(yǎng)物，實驗結果顯示氨基糖苷類藥物可抑制提前終止密碼子，恢復具有功能的全長C7的表達。用慶大霉素治療3例攜帶無義突變的JEB患者角質形成細胞后，層粘連蛋白332全鏈恢復，并在真皮-表皮交界區(qū)沉積。目前正在對RDEB（NCT03392909）和JEB（NCT03526159）進行臨床研究，測試靜脈注射慶大霉素的效果。

3.8 用于緩解癥狀的小分子療法 纖維化是RDEB的主要病理表現(xiàn)，其中TGF-β信號是纖維化和疾病嚴重程度的主要驅動因素［51，52］。氯沙坦是一種血管緊張素II型受體拮抗劑，用于治療高血壓，已被證明可以減少TGF-β的產生。在動物模型中，氯沙坦治療可顯著減少畸形RDEB小鼠爪子的纖維化［53］。此外，Wally等［54，55］及臨床試驗，表明了對重癥EBS患者局部注射白介素-1抑制劑雙醋瑞因［56］能促進其傷口愈合，減少水皰形成。一項研究表明3例嚴重EBS患者接受了磷酸二酯酶-4抑制劑阿普斯特的治療后，皮損較前明顯好轉，該抑制劑能夠調節(jié)炎癥介質網絡（TNF-α、IL-23、IL-17、IL-10等）。雖然上述治療并不能糾正EB的遺傳缺陷，但它能針對治療該疾病的臨床癥狀，改善患者的生活質量。

4 結語

總的來說，EB中基因突變引起了相應結構蛋白的破壞，影響組織的完整性和黏附性，產生相應臨床癥狀。現(xiàn)階段對EB分子病理學和潛在機制更深入的了解及研究為其分子治療的發(fā)展奠定了基礎。目前有關EB的體內外基因治療、蛋白質替換和細胞治療等正進行各個階段的臨床試驗，相信隨著這些研究的進一步深入，能為未來EB患者的治療提供更多更有效、更安全的選擇。