果樹(shù)微芽嫁接技術(shù)研究進(jìn)展

李 根，何 斌，張 成，王 強(qiáng)，朱文杰，楊永波，陳媛媛，肖欣娟

(成都市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川 成都 610041)

微芽嫁接又稱(chēng)莖尖嫁接，是組織培養(yǎng)與嫁接相結(jié)合的一種培育無(wú)毒嫁接苗的技術(shù)[1]。即在無(wú)菌條件下切取樣品的微小莖尖嫁接到組培繁育出的砧木苗上，給予適宜的培養(yǎng)條件，最終愈合發(fā)育成完整植株，以達(dá)到脫毒的效果。由于病毒在植物體中是通過(guò)維管束和胞間連絲傳播，而植物莖尖分生區(qū)細(xì)胞活躍，細(xì)胞分裂速度極快，且沒(méi)有維管束，病毒傳播受限且速度跟不上細(xì)胞分裂速度，因此，莖尖中病毒含量極低，可通過(guò)微芽嫁接技術(shù)獲得脫毒植株。

Murashige等在1972年建立微體嫁接技術(shù)，并在1975年得到Navarro等的改進(jìn)[2]，近年來(lái)，由于微芽嫁接技術(shù)較高的脫毒率，且嫁接植株環(huán)境條件可控，該技術(shù)已在柑橘、獼猴桃、桃等果樹(shù)研究中廣泛應(yīng)用，例如Navarro等在1981年采用此法成功培育出無(wú)病毒的柑橘母本樹(shù)，并建立柑橘母本園，廣泛應(yīng)用在西班牙柑橘產(chǎn)業(yè)中，極大的提高了當(dāng)?shù)馗涕俚漠a(chǎn)量和質(zhì)量。由于大多果樹(shù)均為多年生，且通過(guò)嫁接進(jìn)行繁育，田間材料獲取周期長(zhǎng)，且環(huán)境不可控，接穗材料大多在實(shí)驗(yàn)室組培條件下又難以直接生根繁育，因此，微芽嫁接技術(shù)還能解決果樹(shù)研究中嫁接材料獲取難的問(wèn)題，在較短的周期內(nèi)，獲得條件可控的組培嫁接材料，應(yīng)用于某些研究中。

1 微芽嫁接技術(shù)在果樹(shù)研究中的應(yīng)用

1.1 嫁接親和性的鑒定

近年來(lái)，由于果樹(shù)接穗及砧木新品種選育進(jìn)程加快，嫁接親和性研究對(duì)于新品種在生產(chǎn)中應(yīng)用極為重要，通過(guò)田間常規(guī)嫁接進(jìn)行親和性研究，周期長(zhǎng)，環(huán)境因素影響較大，且部分嫁接組合的不親和需要幾個(gè)月乃至幾年時(shí)間才能完全表現(xiàn)出來(lái)。因此，微芽嫁接技術(shù)可作為嫁接親和性研究的儲(chǔ)備技術(shù)，解決環(huán)境因素不可控、研究周期長(zhǎng)等問(wèn)題。

1.2 植物病毒快速檢測(cè)

目前，在果樹(shù)上常用的病毒檢測(cè)方法一般為木本指示檢測(cè)法，由于果樹(shù)多年生的特性，部分果樹(shù)童期較長(zhǎng)，因此，該方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，一般達(dá)到2年以上，才能成功鑒定出無(wú)病毒苗木，限制了無(wú)毒苗木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和擴(kuò)大。近年來(lái)，由于微芽嫁接技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，結(jié)合該技術(shù)的植物病毒快速檢測(cè)法在無(wú)毒苗木的鑒定與繁育中廣泛應(yīng)用，既縮短了檢測(cè)周期，又加快了果樹(shù)無(wú)毒苗木的繁育。例如在葡萄上已有研究并成功應(yīng)用，研究者以微芽嫁接技術(shù)結(jié)合組培的方式培育帶葡萄扇葉病毒的嫁接植株，培育2～3個(gè)月后葡萄嫁接苗即出現(xiàn)病癥，且病毒檢出率近80%，通過(guò)進(jìn)一步的條件優(yōu)化和改良，檢出率會(huì)進(jìn)一步提高。

1.3 無(wú)毒苗木的快速繁育

目前，各類(lèi)果樹(shù)中優(yōu)質(zhì)主栽品種中，存在較多難以生根的品種，只能通過(guò)嫁接繁育。在生產(chǎn)中繁育苗木一般通過(guò)播種砧木種子，獲得實(shí)生砧木苗，嫁接優(yōu)質(zhì)品種的接穗，達(dá)到繁育的目的。該方法對(duì)接穗和砧木苗的質(zhì)量要求較高，同時(shí)嫁接時(shí)間具有一定的局限性。微芽嫁接技術(shù)中，優(yōu)質(zhì)無(wú)毒莖尖及暗培養(yǎng)的砧木黃化苗較易獲得，以微芽嫁接的方式可以獲得大量的無(wú)毒嫁接苗木，不僅更好的解決了優(yōu)質(zhì)品種難以生根的問(wèn)題，且隨時(shí)可以獲得適宜的嫁接環(huán)境進(jìn)行嫁接，可加快無(wú)毒苗木的繁育速度。

1.4 砧穗互作研究

近年來(lái)，砧穗互作研究成為了果樹(shù)領(lǐng)域的熱門(mén)，通過(guò)砧穗互作的研究，可以直觀的揭示果樹(shù)在嫁接親和性、生理生長(zhǎng)、信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控、長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)确矫嫦嚓P(guān)的相關(guān)機(jī)理。通過(guò)微芽嫁接技術(shù)能夠較快的獲得嫁接植株材料，且不受外界環(huán)境的影響，植株材料也可根據(jù)不同的研究方向進(jìn)行相應(yīng)的處理。除傳統(tǒng)的田間試驗(yàn)外，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可控的外部環(huán)境以及較短的培養(yǎng)周期，讓微芽嫁接技術(shù)成為了砧穗互作研究的“敲門(mén)磚”。

2 影響嫁接成活率的因素

2.1 砧木和接穗

不同的砧木和接穗及其親和性對(duì)于微芽嫁接成活率有較大影響，親緣關(guān)系較近、親和性較好的嫁接組合嫁接成活率一般較高。Lahoty等[3]使用卡里佐枳橙等3種砧木嫁接“那格浦爾”柑橘進(jìn)行微芽嫁接技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)各嫁接組合成活率差異較大，以卡里佐枳橙為砧木嫁接成活率最高。此外，砧木的生長(zhǎng)狀態(tài)也會(huì)影響嫁接成活率。目前多數(shù)研究認(rèn)為砧木苗齡為10～18d時(shí)，微芽嫁接的成活率最高。但也有研究[4]認(rèn)為砧木苗齡只代表砧木的生長(zhǎng)時(shí)間，并不能體現(xiàn)出砧木的生長(zhǎng)狀態(tài)，且會(huì)受到種子質(zhì)量、消毒方式和溫度等的影響。所以也有研究認(rèn)為砧木苗齡與微芽嫁接成活率的關(guān)系不大。

2.2 莖尖大小

微芽嫁接的成活率與莖尖的大小成正相關(guān)，而病毒的脫除率與莖尖的大小成負(fù)相關(guān)。Singh等[5]研究發(fā)現(xiàn)莖尖大小由0.2mm增加到0.5mm，嫁接成活率由30.55%增加到41.66%。莖尖大小0.2mm時(shí)脫毒率為100%，而0.3mm時(shí)脫毒率僅為20%，大于0.3mm則不能脫除印度柑橘環(huán)斑病毒(ICRSV)。莖尖大小除了以長(zhǎng)度衡量外，葉原基數(shù)量也是重要的衡量指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)莖尖小于2個(gè)葉原基，微芽嫁接成活率極低。當(dāng)莖尖大于4個(gè)葉原基，則難以脫除病毒，因此微芽嫁接時(shí)莖尖切取的大小應(yīng)為2～3個(gè)葉原基[6]。

2.3 嫁接方法

微芽嫁接的常見(jiàn)方法有7種，包括倒T形法、頂接法、嵌芽腹接法、點(diǎn)接法、△形法、⊥壓法和橫壓法。研究表明不同的嫁接方法對(duì)于微芽嫁接成活率具有較大的影響，有些方法成活率高但操作較為復(fù)雜，而有些方法成活率稍低但操作簡(jiǎn)單、快捷，因此需針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)情況選擇適宜的方法[7]。

2.4 培養(yǎng)條件

研究表明微芽嫁接所用的砧木材料為暗培養(yǎng)的黃化苗時(shí)，能提高微芽嫁接的成活率，且嫁接后的試管苗需在特定環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)[8]。砧木試管苗先暗培養(yǎng)14d，此時(shí)的砧木黃化苗能與接穗更好地結(jié)合，從而提高嫁接成活率。此外，植物激素的使用同樣影響嫁接成活率。劉柏玲等[9]在微芽嫁接實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的6-BA和GA3對(duì)德?tīng)査某取⒓~荷爾臍橙等8個(gè)品種柑橘進(jìn)行了處理，結(jié)果顯示不同激素對(duì)不同品種的嫁接成活率差異明顯，且使用植物激素進(jìn)行預(yù)處理的嫁接成活率均高于使用蒸餾水進(jìn)行預(yù)處理的對(duì)照。

3 總結(jié)與展望

微芽嫁接技術(shù)自1972年建立以來(lái)，經(jīng)過(guò)研究者們多年的探索與改進(jìn)，目前該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)較為成熟和完善，應(yīng)用程度較高，特別是在果樹(shù)上。微芽嫁接技術(shù)主要應(yīng)用于嫁接親和性的鑒定、植物病毒快速檢測(cè)、無(wú)毒苗木的快速繁育，此外，還可應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)的某些研究體系中。通過(guò)一些生物技術(shù)結(jié)合微芽嫁接技術(shù)，可以解決果樹(shù)育種及生產(chǎn)問(wèn)題，同時(shí)還可能實(shí)現(xiàn)果樹(shù)優(yōu)良種質(zhì)的創(chuàng)造，如通過(guò)對(duì)柑橘微芽嫁接材料進(jìn)行輻射誘變育種，可以極大的提高基因突變頻率，通過(guò)篩選出其中的小量突變，在改良品種的同時(shí)又可保證原有品種的優(yōu)良性狀。影響嫁接成活率的因素除文中所述的四點(diǎn)外，還包括砧木和接穗的親和性、莖尖采集的季節(jié)及氣候條件等[10]。如在夏季7-8月，由于氣候高溫干燥，抑制了細(xì)菌的繁殖，因此，進(jìn)行微芽嫁接時(shí)污染率較低。柑橘在春季由于花芽迅速萌發(fā)，與新梢形成了營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，莖尖生理活性下降；秋季溫差變化加大，接穗生理活性降低，因此嫁接成活率也會(huì)降低。綜上，在夏季取柑橘莖尖，嫁接成活率最高，污染率也較低。

目前，微芽嫁接技術(shù)已較為成熟，但因其材料、嫁接操作和培養(yǎng)條件要求較為嚴(yán)格，因此該技術(shù)培養(yǎng)嫁接離體材料的效率相比于傳統(tǒng)的離體培養(yǎng)技術(shù)仍偏低，除已知的影響因素外，研究者們可進(jìn)一步針對(duì)其他影響因素進(jìn)行控制性實(shí)驗(yàn)，以期進(jìn)一步優(yōu)化該技術(shù)。此外，除了應(yīng)用在傳統(tǒng)的大宗果樹(shù)外，還可適當(dāng)應(yīng)用于部分小宗果樹(shù)，拓展研究領(lǐng)域，針對(duì)其生理生化特性進(jìn)行探索和嘗試。