瓜類枯萎病抗性遺傳育種研究進展

琚茜茜 黃如葵 黃熊娟 馮誠誠 黃玉輝 楊浩

（1.廣西壯族自治區農業科學院蔬菜研究所 廣西南寧 530007；2.廣西蔬菜育種與新技術研究重點實驗室 廣西南寧 530007；3.廣西樂土生物科技有限公司 廣西南寧530007）

瓜類枯萎病（Fusarium wilt）又稱萎蔫病，是由鐮刀菌寄生引起的土傳病害，也是瓜類生產中的毀滅性病害。隨著瓜類蔬菜產業的快速發展，各地專業化和集約化種植，引發了嚴重的瓜類蔬菜連作障礙問題，枯萎病發病率呈直線上升趨勢。據調查，在一般病區枯萎病的發病株率為12.30%~56.75%，而在重病區的發病株率達到85%以上，甚至全部死亡，給瓜類生產帶來了巨大的經濟損失。

枯萎病致病機理主要存在導管堵塞和毒素的作用。病原菌侵染植株后，分泌出水解酶，使細胞壁發生降解，引起植株根系中胼胝質的積累，從而造成導管堵塞以及養分運輸受阻，最終使植株枯萎死亡[1]。并且毒素的合成能夠使植株維管束細胞發生變褐、壞死等病理變化[2]。由于枯萎病病原菌具有寄主專化性，各分化型對不同瓜類作物的侵染力和致病力存在差異[3]，部分瓜類專化型菌株還存在不同的生理小種，防治十分困難。現有的防治措施未能有效防治瓜類枯萎病。因此，選育高抗枯萎病瓜類蔬菜新品種是最經濟、有效的解決方法。目前，國內外已對瓜類枯萎病開展了較詳細的研究，其中對西瓜、黃瓜枯萎病的研究較為深入[4]。本文主要對西瓜、黃瓜、苦瓜、冬瓜等瓜類作物枯萎病的抗性鑒定、抗性遺傳、分子標記輔助育種等進行綜合概述，以期為瓜類枯萎病的抗性遺傳育種提供參考。

1 瓜類枯萎病抗性鑒定

選擇合適的接種方法，是篩選鑒定抗性材料的基礎。目前，關于瓜類枯萎病抗性鑒定的方法主要采用灌根接種法、傷灌根接種法及浸根接種法，在不同的瓜類上都開展了相關研究。在黃瓜上，國外使用比較普遍的方法是菌土法和灌根法[5]。而國內采用較多的方法是灌根接種法、浸根接種法和胚根接種法。周紅梅等[6]采用灌根接種法、浸根接種法和胚根接種法進行枯萎病抗性鑒定，結果表明，浸根接種法發病迅速，整齊度、重復性好，是較理想的黃瓜枯萎病接種方法；董京萍等[7]以灌根的方式對 70個黃瓜自交系進行枯萎病抗性差異分析，分別篩選出了對枯萎病抗性最強和最弱的品系。在西瓜上，張學煒等[8]開展了西瓜抗枯萎病鑒定方法的研究，認為浸根法最好，最適宜濃度為 1×105~1×106孢子/mL。王喜慶等[9]對抗病鑒定方法進行了篩選，結果表明，最佳的方法為浸根接種法，最適宜濃度 1×105孢子/mL，2018年李曉慧等[10]也開展了此研究，認為傷根蘸孢法是較為理想的接種方法，該方法是在浸根接種法的基礎上，對西瓜幼苗剪根處理，通過剪根控制傷根的均勻程度。在甜瓜上，王登明等[11]和劉朋義等[12]分別采用不同接種方法進行抗性接種鑒定研究，認為浸根接種法操作簡單、精確，最適合進行甜瓜枯萎病抗病鑒定研究，并成功鑒定出甜瓜高抗枯萎病材料。關于苦瓜枯萎病抗性接種鑒定的方法，也開展了少量的研究。郭堂勛等[13]研究認為，浸根接種法較適用于苦瓜枯萎病的抗性鑒定。陳振東等[14]采用苗期浸根接種法對143份苦瓜高代自交系材料進行枯萎病抗性評價，鑒定出高抗枯萎病特性的材料 1份、抗病材料 2份、中抗材料5份。眾多研究表明，開展瓜類枯萎病苗期接種鑒定，最佳的方法是浸根接種法，操作簡單、結果準確。

2 瓜類枯萎病抗性遺傳研究

瓜類枯萎病抗性遺傳規律較為復雜，遺傳抗性呈現多種特點。目前，國內外有關瓜類枯萎病抗性遺傳作用機理的研究主要集中在黃瓜、甜瓜及西瓜上。在黃瓜抗枯萎病遺傳規律方面，部分學者的研究認為，黃瓜枯萎病的抗性由單顯性基因控制[15-17]，同時也存在單基因顯性、單基因隱性、寡基因抗性以及數量性狀遺傳的特點[18]。樂素菊等[19]建立黃瓜抗枯萎病遺傳模型，認為其符合 Mather 的加性—顯性遺傳模型，抗性遺傳組成成分以加性遺傳為主，部分不完全正顯性，顯性作用的效應不等。Dong 等[20]以黃瓜抗感自交系為材料，采用主基因+多基因混合遺傳模型分析，認為其遺傳符合兩對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因混合遺傳模型。在甜瓜方面，前人利用不同的材料針對此研究得出了不同的結果。Chikh-Rouhou等[21]對4個甜瓜品種開展了枯萎病抗性遺傳研究，結果表明，其遺傳是由一個復雜基因控制的多基因遺傳。A.Oumouloud等[22]研究發現，甜瓜對枯萎病的抗性遺傳分別由一個隱形基因和一個顯性基因獨立控制。Perchepied等[23]利用重組自交系進行甜瓜抗枯萎病生理小種 1,2的遺傳機制研究，結果表明，其抗性屬于多基因遺傳。Herman等[24]認為，香瓜抗枯萎病遺傳是由2個互補的隱性基因控制。由于材料的不同以及部分專化型生理小種的分化，西瓜枯萎病抗性遺傳規律更為復雜。Netzer[25]、Zhang等[26]以及周鳳珍等[27]的研究結果認為，西瓜枯萎病的抗病性由單顯性基因控制。鄒小花等[28]采用2種遺傳模型分析結果顯示，PI296341-FR 對西瓜枯萎病菌生理小種2的抗性遺傳由主基因和微效基因共同控制，微效基因加性效應與顯性效應的絕對值均高于主基因。羊杏平等[29]采用Griffing雙列雜交方法Ⅱ配制組合，認為西瓜對枯萎病抗性由隱牲多基因控制，其遺傳符合加性-顯性模型，不同西瓜抗性材料的雜交組合表現的遺傳規律不一致。其他瓜類方面，趙秀娟等[30]和劉子記等[31]開展了苦瓜抗枯萎病的遺傳機制研究，但2位學者的研究結果卻各不一致，分別認為苦瓜枯萎病抗性受單一顯性核基因控制和2對主基因控制。此外，冬瓜枯萎病抗性是由隱性多基因控制，符合加性-顯性模型，以加性效應為主，感病對抗病表現為部分顯性[32]。

3 瓜類抗枯萎病分子標記與基因定位

近年來，隨著分子育種技術研究的不斷深入，更多的育種家開始采用分子標記輔助育種手段開展瓜類抗枯萎病育種研究，加速育種進程。利用抗枯萎病基因的已知序列或與抗枯萎病基因緊密連鎖的分子標記，可以快速準確地篩選抗病植株，提高抗病育種效率。

3.1 黃瓜

國內外有關黃瓜抗枯萎病分子標記輔助育種開展較多，已篩選出一系列與抗枯萎病基因緊密連鎖的分子標記。王亞娟[33]采用 SSR 和 AFLP技術，以抗枯萎病黃瓜親本 Q9和感枯萎病親本Q10的F2分離群體為試驗材料，研究了與黃瓜抗枯萎病基因緊密連鎖的分子標記，分別找到1個與黃瓜抗枯萎病基因連鎖的共顯性標記（E25M70-170 bp/167 bp），1個 SSR標記（CSWCT06A）。與黃瓜抗枯萎病基因間的距離分別為8.12和5.98 cM。張海霞等[34]和張海英等[35]以 WI2757和津研 2號及 F2代為試材，運用RAPD和AFLP標記技術，基于BSA分析方法獲得了與WIS2757抗黃瓜枯萎病基因連鎖的RAPD和AFLP標記，遺傳距離為14和7 cM。另外，Vakalounakis[36]研究發現，黃瓜抗枯萎病基因與抗黑星病基因緊密連鎖。毛愛軍等[37]利用WIS2757×JY-2為遺傳群體，發現抗枯萎病基因和抗黑星病基因連鎖，連鎖距離為17.5 cM。隨著黃瓜抗枯萎病分子育種研究的不斷進步，在黃瓜枯萎病抗性基因定位方面也取得了一些進展，Zhang等[38]在不同時間開展了有關黃瓜枯萎病抗性基因的定位及分子標記開發，在位于 SSR03084-SSR17631的區域篩選出一個主要的QTL-Foc2.1，在染色體2上的遺傳距離為2.4 cM。并且驗證了與Foc2.1相關的SSR17631的有效性。Dong 等[20]基于BSA-seq技術，開展黃瓜抗枯萎病QTL定位，將1個主效QTL定位于2號染色體上，并且利用5對 Indel引物將其精細定位于 2號染色體上的1 248 093~1 817 308 bp，其中包含了80個候選基因。周紅梅等[39]也以WIS2757×津研2號及F2分離群體為試材，通過SSR分析，獲得與黃瓜枯萎病抗性基因（Foc-4）緊密連鎖的SSR標記9個，將基因Foc-4定位于2號染色體上，連鎖距離分別為1.0和0.9 cM。

3.2 西瓜

1999~2000年，徐勇等[40-41]運用RAPD技術，首次獲得了與生理小種 1號抗性基因相關的RAPD 標記。之后進行克隆、測序，并轉化為SCAR標記，初步建立了西瓜抗枯萎病育種分子標記輔助選擇技術系統。Leigh等[42]構建了西瓜抗枯萎病的連鎖圖譜，篩選出與生理小種1號和2號抗性相關的 RAPD 標記。隨著二代高通量測序技術的發展，張屹等[43]通過BSA法，將Fon-1基因定位于1號染色體15 cM區間內，利用候選SNP位點信息，開發3個CAPS/ dCAPS標記，可以有效區分栽培西瓜對枯萎病菌生理小種1的抗病性。李娜等[44]基于重測序技術，成功將 Fon-1基因精細定位，通過主效QTL（Fon-1）驗證了枯萎病抗性基因的存在，并且新開發了與Fon-1基因緊密連鎖的InDel1_fon1標記，能夠快速高效地用于西瓜抗枯萎病分子標記輔助育種。張敬敬等[45]利用許勇團隊開發的西瓜抗枯萎病分子標記，借助高通量分型KASP標記技術對西瓜枯萎病抗性相關基因進行了檢測，成功篩選到抗枯萎病材料38份。

3.3 甜瓜

甜瓜枯萎病抗性基因及分子標記研究也取得一些進展，早在1985年，Zink[46]就報道了甜瓜中抗枯萎病的基因有3個，Fom-1、Fom-2、Fom-3。Oumouloud等[47]利用抗病和感病試材，構建 F2分離群體，運用RAPD技術篩選到3對在抗病、感病植株間存在差異的引物，并通過PCR對片段進行克隆并分析差異序列的堿基，開發出與Fom-1基因連鎖的SCAR標記。王士韋[48]通過基因克隆和序列比對獲得3個SNP多態性位點，在F1和F2群體中，采用CAPS和AS-PCR兩種分子標記驗證多態性SNP位點的有效性和可靠性，并轉化為功能性分子標記，成功篩選到抗病材料，為甜瓜抗枯萎病育種提供重要的資源。楊加付等[49]從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2，通過實時熒光定量PCR分析，白啄瓜經枯萎病接種后，Fom-2基因表達明顯上調，為白啄瓜抗病育種奠定了基礎。Tezuka等[50]設計了很多與Fom-1基因連鎖的分子標記，并且對其基因位點進行圖位克隆，推測其位于 C-MRGH13和62-CAPS標記之間，間距為 137.462 bp。Oumouloud 等[51]在 Fom-1基因編碼區根據單一核苷酸多態性設計了2個CAPS標記Fom-1R和Fom-1S，在甜瓜育種進程中的分子標記輔助選擇方面起重要作用。Sousaraei等[52]利用標記輔助回交技術，將一個抗性基因型(Isabelle)的form-2基因導入2個感病品種，成功開發出2個功能性分子標記Fom2-R409和Fom2-S253，這2個標記比接種試驗更準確、高效，可作為甜瓜抗枯萎病基因型篩選的可靠工具。

4 瓜類抗枯萎病品種選育

目前，選育抗病品種是防治枯萎病最有效，最根本的辦法。黃瓜在抗枯萎病品種選育方面已經取得很大的突破，生產上高抗枯萎病的黃瓜品種主要有東北農業大學研發的東農系列（東農812、東農807、東農808等）[53-55]和天津科潤黃瓜研究所培育的津優48號和津優49號，其中津優 49號的親本是通過主要病害分子鑒定技術和田間選擇相結合選育而成[56-57]。中國西瓜優勢產區設施栽培品種中缺少高抗枯萎病品種[58]，近10年來，在西瓜抗病育種中重點開展了抗枯萎病育種，先后培育出了愛能5號、農科大11號等高抗枯萎病西瓜新品種[58-59]。除此之外，還有很多西瓜品種都達到了抗的水平，例如榆農系列（榆農6號、榆農10號）和新優69號、鄭抗2008等[60-63]。

5 展望

瓜類枯萎病對瓜類生產造成了十分嚴重的危害，現有的防治措施包括化學防治、農業防治等都不能有效的防治，最經濟有效的防治方法是選育抗病品種。抗病資源和抗性遺傳規律是抗病育種的前提和基礎。目前，國內抗病資源十分有限，尤其是高抗和免疫材料十分匱乏。除此之外，部分瓜類抗性遺傳規律的不確定性，都給瓜類抗病育種帶來了諸多困難。利用常規育種方法進行抗病育種耗時長、難度大，并且隨著病原菌不斷分化，抗病品種的抗性具有局限性；分子標記輔助育種作為一種高效的現代育種技術將成為瓜類作物抗病育種的主要技術手段。目前，黃瓜、苦瓜等已完成全基因組測序，利用新一代測序技術，開展瓜類作物的基因組學研究，可以較短時間完成瓜類作物抗枯萎病分子標記的開發及抗性基因定位，快速創制豐富瓜類抗枯萎病資源。另外，隨著研究的不斷深入,分子標記輔助育種將會采用更多新的標記技術，更加快速、有效地解決瓜類蔬菜抗病育種難題。