肉雞球蟲病防治新技術(shù)研究進展

趙麗萍

（四川省廣元市蒼溪縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川廣元 628400）

規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖過程中發(fā)生球蟲疾病會導致雞群生產(chǎn)性能和機體健康狀況顯著下降，嚴重制約了雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，球蟲疾病的防治是現(xiàn)階段規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖中的熱點問題。以往肉雞球蟲疾病的防治措施主要集中在化學藥物預(yù)防及球蟲疫苗注射等防治中，均存在一定的弊端，主要包括球蟲蟲株出現(xiàn)耐藥性及疫苗有效性差等問題，難以完善的預(yù)防肉雞養(yǎng)殖過程中球蟲疾病的出現(xiàn)[1]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，肉雞養(yǎng)殖過程中球蟲疾病的防治措施也逐漸進步，現(xiàn)階段，研發(fā)的肉雞養(yǎng)殖球蟲疾病預(yù)防新途徑主要包括肉雞抗球蟲疾病育種，雞球蟲病抗性差異基因的芯片篩選，肉雞球蟲抗性相關(guān)基因的研究及肉雞球蟲抗性細胞水平的基礎(chǔ)研究等方面，均為肉雞養(yǎng)殖球蟲疾病的良好防治帶來了巨大的幫助。下文將對現(xiàn)階段肉雞養(yǎng)殖中球蟲疾病的防治新技術(shù)進行介紹，以期為肉雞球蟲疾病的有效防治及我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供幫助。

1 新型球蟲疫苗的開發(fā)

免疫疫苗在肉雞養(yǎng)殖中對球蟲疾病的預(yù)防發(fā)揮了關(guān)鍵作用，同時，隨著現(xiàn)階段基因工程技術(shù)的不斷進步，球蟲疫苗研究者開始探索球蟲疾病基因重組疫苗，希望可以通過基因工程技術(shù)對球蟲的特定生長階段的抗原來研制具有抗球蟲效果的亞單位疫苗。但由于現(xiàn)階段技術(shù)儲備有限，這種基因重組疫苗的研發(fā)還處于起步階段。目前對基因功能技術(shù)的疫苗研發(fā)主要集中在DNA 疫苗和蛋白疫苗，這兩種疫苗隨著現(xiàn)階段分子生物學的快速進步和動物免疫學基礎(chǔ)和技術(shù)的革新，DNA 疫苗和蛋白疫苗的研發(fā)應(yīng)用獲得了快速發(fā)展。早期通過在肌細胞表面可以表達裸DNA 后，研究人員開始DNA 疫苗在球蟲疾病疫苗上的開發(fā)探索。后續(xù)通過將編碼折光體蛋白S07 構(gòu)建到真核細胞的表達載體上，通過肌肉注射可以有效免疫肉雞養(yǎng)殖中柔嫩艾美耳球蟲，顯著降低了肉雞養(yǎng)殖中由于柔嫩艾美耳球蟲感染導致的盲腸病變，同時對患病肉雞的生產(chǎn)性能有良好的恢復作用。研究學者通過在表達堆型艾美耳球蟲的子孢子表面抗原3-1E 中的真核部位，表達質(zhì)粒中pMP13 后給肉雞進行肌肉注射或皮下注射，隨后進行堆型艾美耳球蟲感染，感染時間維持10d 左右，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組感染肉雞的血清中抗體水平較對照組有顯著提高，而且試驗組肉雞機體免疫T 細胞的含量顯著上升，說明這種DNA 疫苗可有效激活肉雞的免疫應(yīng)答，緩解由于球蟲感染對機體造成的負面影響。還有研究學者通過將含有表達多種細胞因子基因的真核表達載體和pcDNA3-1E 給肉雞進行共同免疫后，攻毒試驗發(fā)現(xiàn)試驗組肉雞機體球蟲排出的卵囊總數(shù)顯著降低，說明提高細胞因子的表達量可以作為球蟲疫苗的佐劑改善DNA 疫苗的疾病防治效果。現(xiàn)階段對這些細胞因子的研究主要集中在IFN-γ、IL-8、IL-15、IL-1β、TGF-β4 等。

亞單位疫苗也是現(xiàn)階段肉雞養(yǎng)殖中球蟲疾病基因重組疫苗的重要組成部位，亞單位疫苗主要是通過將雞球蟲抗原蛋白進行重組后表達，制作新型的蛋白疫苗。通過科學的鑒定肉雞養(yǎng)殖中球蟲感染的某一個生活階段，利用這種特異性抗原蛋白對肉雞進行免疫處理，進而激發(fā)肉雞免疫性能。目前對這種類型的亞單位疫苗主要集中在球蟲發(fā)育階段中的蟲體表面蛋白，包括子孢子階段、裂殖子階段、配子階段等。肉雞養(yǎng)殖中堆型艾美耳球蟲表面的cMZ-8、MA1、3-1E、Ea1A 等抗原可有效誘導肉雞免疫反應(yīng)，還包括柔嫩艾美耳球蟲中GX3262 和SZ-1等抗原也具有同樣的效果，通過將這些抗原進行重組后可以有效激發(fā)肉雞機體中對球蟲的免疫反應(yīng)，進而獲得抗球蟲的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過在巨型艾美耳球蟲配子階段中抗原gam56 和gam82 誘導的免疫反應(yīng)對肉雞養(yǎng)殖中出現(xiàn)的巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲及柔嫩艾美耳球蟲的免疫均有良好效果，因此，現(xiàn)階段這種亞單位疫苗在肉雞實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中已進行開發(fā)利用。肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中可通過使用球蟲DNA 疫苗對肉雞進行初次免疫防治，隨后再通過使用亞單位疫苗加強肉雞養(yǎng)殖中球蟲疾病的疫苗防治，這種方式將有效提高肉雞對球蟲感染的免疫能力。研究發(fā)現(xiàn)，這種復合免疫的方式不僅對球蟲這種寄生蟲有良好的防治作用，對伊氏錐蟲的感染也具有良好的免疫防治效果，可以說，復合免疫可能是未來肉雞養(yǎng)殖中球蟲免疫的重要方向。

2 肉雞抗球蟲品種的選育

肉雞抗球蟲品種的選育是現(xiàn)階段肉雞球蟲疾病防治的新方向，從根本上降低了肉雞養(yǎng)殖過程中球蟲疾病出現(xiàn)的概率。肉雞抗球蟲品種的選擇主要是通過基因技術(shù)手段實現(xiàn)，利用感染球蟲肉雞排出的球蟲卵囊，通過單基因座分析的方法，鑒別出肉雞基因中1 號染色體中LEI0071 標記的LOD 值為2.45，而肉雞基因中LEI0101 的標記處也證明這個基因片段與球蟲疾病的抗病能力顯著相關(guān)，同時通過多重比較分析發(fā)現(xiàn)，肉雞球蟲疾病的抗性基因中與卵囊中的QTL 等位基因有較強的相關(guān)性。同時有研究學者表明，肉雞球蟲感染的卵囊脫落數(shù)是評價肉雞球蟲疾病抗性或是否易感球蟲疾病的關(guān)鍵指標，在肉雞基因染色體的80%區(qū)域中超過119 個微衛(wèi)星標記顯示肉雞球蟲卵囊脫落數(shù)定位在肉雞基因1 號染色體的259cM 處，同時在肉雞基因中1、6、8 號染色體中含有3 個潛在增重QTL，為后續(xù)肉雞球蟲抗病基因的選育研究奠定了良好的基礎(chǔ)[2]。

3 肉雞抗球蟲差異基因的芯片篩選

肉雞抗球蟲差異基因的芯片篩選是現(xiàn)階段肉雞養(yǎng)殖中球蟲疾病防治的新手段，主要是通過以球蟲疾病抗性和易感球蟲疾病的肉雞品系為試驗材料，通過研究肉雞球蟲自然抗性基因的表達譜來進行差異基因芯片的篩選。研究學者通過比較肉雞二次感染堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲及柔嫩艾美耳球蟲后肉雞后腸段腸上皮淋巴細胞中10 Kc DNA 基因芯片的表達譜的差異，獲取感染后肉雞腸道上皮細胞中基因芯片的表達譜差異，結(jié)果顯示，在感染的第1、2 和3 天后，3 種球蟲感染出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄改變數(shù)量無顯著差異，而在后續(xù)4、5、和第6 天及二次球蟲感染后的時間點上，肉雞機體感染柔嫩艾美耳球蟲出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄改變數(shù)量最多，通過對整個試驗周期中6 個時間點的球蟲感染基因上調(diào)或下調(diào)轉(zhuǎn)錄水平變化分析發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲感染情況在第1 次和第2 次中檢測到上調(diào)的感染轉(zhuǎn)錄數(shù)無顯著差異，而球蟲感染基因下調(diào)的水平在第2 次中略高于第1 次，而另外兩種球蟲感染情況，無論是基因水平的上調(diào)還是下調(diào)，第2 次表達高于第1 次的表達。同時研究發(fā)現(xiàn)，3 種球蟲感染中出現(xiàn)的生物學通路分析鑒定研究發(fā)現(xiàn)，基因水平轉(zhuǎn)錄物質(zhì)的改變主要集中在與動物機體發(fā)育中疾病和機體系統(tǒng)生長發(fā)育相關(guān)的基因表達。通過對肉雞球蟲疾病抗性相關(guān)差異基因的篩選研究可以發(fā)現(xiàn)，可以對差異基因的功能作用及基因之間的相互作用進行進一步研究，進而為肉雞養(yǎng)殖過程中球蟲疾病在分子水平上的研究選育提供良好的基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐[3]。

4 肉雞球蟲抗性基因的研究

肉雞球蟲抗性基因的研究可以通過在分子基因水平對球蟲感染進行良好預(yù)防，研究學者發(fā)現(xiàn)，肉雞球蟲疾病抗性與肉雞基因染色體中1 號染色體微衛(wèi)星標記的LEI0071 和LEI0101 之間密切相關(guān)，后續(xù)在這兩個標記中選擇了3 個候選基因，分別是斑聯(lián)蛋白、CD4 及腫瘤壞死因子受體超級家屬1A。通過染色體坐標及相關(guān)免疫學功能檢測，對SNP 和肉雞球蟲疾病抗性指標的關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，斑聯(lián)蛋白基因中多個單核苷酸的突變位點與肉雞球蟲疾病抗性指標中β-胡蘿卜素、NO2-/NO3-的濃度有密切關(guān)系，同時也與肉雞球蟲感染后糞便中卵囊脫落數(shù)顯著相關(guān)，說明斑聯(lián)基因多個變異位點與肉雞球蟲疾病抗性有顯著相關(guān)關(guān)系，為后續(xù)肉雞球蟲疾病防治的分子基因水平的研究提供了依據(jù)和幫助[4]。

5 肉雞球蟲疾病抗性細胞的研究

研究學者通過分離培養(yǎng)肉雞柔嫩艾美耳球蟲的宿主感染細胞，雞胚盲腸上皮細胞，通過獲得純度情況良好的原代雞胚盲腸上皮細胞，再通過研究柔嫩艾美耳球蟲在雞胚盲腸上皮細胞中的體外培養(yǎng)條件，保障柔嫩艾美耳球蟲在雞胚盲腸上皮細胞中的生長發(fā)育及繁殖條件，再通過研究雞胚上皮細胞的傳代培養(yǎng)，獲取較為穩(wěn)定，數(shù)量較大，同時細胞活性較高，純度良好的雞胚盲腸上皮細胞。這些細胞研究可有效幫助肉雞球蟲疾病在細胞水平上的抗性基因研究[5]。

6 小結(jié)

現(xiàn)階段，在規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖過程中，肉雞養(yǎng)殖數(shù)量不斷提高，傳染性疾病的出現(xiàn)嚴重損害了肉雞養(yǎng)殖效益。在肉雞養(yǎng)殖中，球蟲疾病的防治新技術(shù)可以從分子和基因水平上降低球蟲疾病的出現(xiàn)概率，為肉雞健康養(yǎng)殖帶來幫助。