漢江上游干支流沉積物細菌群落多樣性和影響因素

朱慶威，潘保柱，孫 賀，何浩然，趙耿楠

(西安理工大學西北旱區生態水利國家重點實驗室，陜西 西安 710048)

河流沉積物是自然環境的基本組成部分和元素遷移轉化的載體，在水生生態系統營養循環中既是源又是匯[1-2]，是水體和陸地的重要污染物儲存庫[3]。在河流生態系統中，沉積物對人為干擾和自然災害引起的環境條件變化非常敏感[4]，沉積物中的細菌多樣性是水質評價的重要指標，能反映河流的污染程度和河流沉積物中污染物的遷移和轉化規律[5-6]，細菌群落結構的形成是長期環境變化作用的結果；且細菌群落在物質循環和能量輸運中起著關鍵作用，反映了不同的生態功能[7]，因而沉積物細菌群落結構可以很好地反映細菌環境變化的貢獻以及對環境干擾的反饋[8-9]。

闡明細菌群落組成和確定多樣性分布的原因是細菌生態學的核心目標[10-11]，其中生態位理論和中性理論最為重要[12-13]。生態位理論認為生物群落由環境選擇和生物相互作用調控，屬于確定性過程[14-16]；中性理論認為群落中所有的物種具有相同的競爭和擴散能力，因此群落的組成受隨機漂移的影響，隨機過程塑造生物群落[17-18]。近年來，在海洋[19]、土壤[20]、湖泊[16]和河流水體[21]中已經證實中性過程在塑造生物群落中發揮重要作用，而針對沉積物細菌群落構建機制的研究[22]較少。

本文選取丹江口水庫以上的漢江上游以及源于秦嶺南麓的5條典型支流為研究對象，由于人為干擾和自然環境的影響，這些河流呈現強烈的環境梯度和相當大的生境異質性，為探索不同驅動因素在河流生物群落中的作用提供了一個理想的試驗場[23]。該地區是北亞熱帶和暖溫帶的過渡地帶，地貌景觀獨特，是我國重要的生物多樣性熱點地區之一[24]。針對該流域沉積物細菌群落構建的影響機制的研究尚未見報道，對沉積物細菌群落結構的調控機制尚不清楚。本文采用高通量測序技術對漢江上游干流以及5條支流開展了系統的水化學和沉積物細菌群落研究，分析沉積物細菌群落形成過程中所受的生態機制影響，旨在了解漢江上游及其支流沉積物細菌群落的影響機制，確定影響細菌群落形成的主導過程。

1 材料與方法

1.1 研究區域與采樣方法

漢江是長江最大的支流，發源于秦巴山地的寧強縣，其中丹江口以上為漢江上游，它的支流發源于秦嶺山脈。南水北調中線工程的水源地為丹江口水庫，因此漢江上游及其支流是南水北調中線工程的來水區。漢江上游長約400 km，流域面積約5.47萬km2。漢江流域年平均氣溫14℃，年平均降水量895 mm，5—10月為汛期，降水量約占全年的80%。

在2017年11月和2018年4月對32個斷面進行了取樣。其中漢江上游選取7個斷面，每條支流(湑水河、金水河、月河、旬河、金錢河)各選取5個斷面(圖1)。以采樣斷面為中心，上下游各50 m的范圍為采樣區域，每個斷面設置3個采樣點，每個采樣點之間距離20 m。采用抓斗式采泥器采集沉積物表層樣品，樣品采集后，將每份樣品一分為二，一份約1 kg，立即放入無菌的聚乙烯自封袋中，用于理化指標的測定，采集后迅速運回實驗室進行后續處理；另一份裝入無菌離心管中保存于-80℃的環境中，用于細菌群落結構分析。每個斷面3個采樣點的沉積物樣品混合均勻。沉積物樣品總磷(TP)、總氮(TN)、總有機碳(TOC)的理化特性檢測按照《土壤農業化學分析方法》[25]進行，土壤粒徑使用馬爾文Mastersizer 2000激光粒度儀測量。

圖1 漢江上游干支流采樣斷面分布Fig.1 Location of sampling sections in upper reaches of the Hanjiang River and tributaries

1.2 DNA提取、擴增和測序

稱取約0.5 g經冷凍干燥后的底泥樣品，使用MOBIO PowerSoil?試劑盒提取DNA，利用Thermo NanoDrop One分光光度計檢測DNA的完整性、純度和濃度。以基因組DNA為模板，使用帶barcode的特異引物及TaKaRa Premix Taq?Version 2.0(寶日醫生物技術(北京)有限公司)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增。對細菌16S rRNA的V4、V5區域進行PCR擴增，引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)[26]。PCR反應體系包括20 ng/μL的DNA 3 μL，0.01 mol/L前、后引物各1 μL，2x反應緩沖液25 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；接著30個循環為：94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸10 min，在4℃下存儲。每個樣本進行3次重復，并將同一樣本的PCR產物進行混合。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的片段長度和濃度，主帶長度在正常范圍內(300 bp左右)的樣品可用于進一步的試驗。利用GeneTools軟件(Version 4.03.05.0，SynGene)對PCR產物進行濃度對比，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各PCR產物進行混合。使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收PCR混合產物，Tris-EDTA緩沖液洗脫回收目標DNA片段。按照NEBNext?UltraTMII DNA Library Prep Kit for Illumina?(New England Biolabs，美國)標準流程進行建庫操作。使用Illumina MiSeq2500平臺進行測序。

1.3 數據預處理

原始FASTQ文件使用QIIME 2(版本2019.01)進行質量控制、標注和統計計算[23,27-28]。處理和分析已去除引物和低質量的序列，然后使用DADA2對序列進行降噪，以獲得精確序列變體(Amplicon sequence variants，ASVs)[29-30]。ASVs相當于100%的操作分類單元(OTUs)。對比Silva 16S rRNA數據庫的基因序列進行分類。在進行后續分析之前，葉綠體、線粒體、古菌和真核生物被清除。最后，為了最大限度地減少測序深度不同造成的影響，以最低序列數(24 929)為標準，將得到的ASVs表中的所有樣品的序列重新抽樣至每個樣品的序列數相等。

1.4 數據分析

Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和Pielou指數用R語言vegan包計算[31]，沉積物細菌物種分類韋恩圖用R語言VennDiagram包計算。采用Mann-Whitney U檢驗法評估多樣性指數的組間差異。Beta多樣性采用基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)排序來分析季節和河流之間沉積物細菌群落的差異。NMDS是距離值的秩次(數據排名)信息的評估，圖形上樣本信息僅反映樣本間數據秩次信息的遠近，不反映真實的數值差異，橫縱坐標并無權重意義。采用相似度分析(analysis of similarities，ANOSIM)來評估組間的分離程度，分離度R值越大，組間分離度越高(R=1表示完全分離，R=0表示完全未分離)，這些分析是使用R語言中的vegan包進行的。

表1 漢江上游干支流沉積物理化性質Table 1 Physicochemical properties of sediment in upper reaches of the Hanjiang River and its tributaries

將除pH值以外的理化參數數值n進行對數轉換為lg(n+1)正態值進行多元統計分析，使用SPSS軟件對理化因子進行差異分析，采用單因素方差分析中的多重比較法進行差異顯著性檢驗，采用Mantel檢驗分析計算細菌群落Bray-Curtis矩陣與環境因子的歐氏距離之間的Spearman等級相關性，以及細菌群落Bray-Curtis矩陣與地理距離之間的Spearman等級相關性。結合中性群落模型(neutral community model，NCM)研究確定性過程和隨機性過程對細菌群落的貢獻，使用NCM將觀測到的ASVs發生頻率與元群落的平均相對豐度聯系起來[13]。NCM可以反映Hubbell中性理論對大微生物種群的適應性[12]，其計算過程可參考文獻[32]。采用參數R2表示NCM的整體擬合度，R2越高表明越接近中性模型，即群落的構建受隨機性過程的影響越大，受確定性過程的影響越小。標準化隨機率(NST)也被證實可以預測細菌群落組裝[33]，也是用來評估群落確定性(<50%)和隨機性(>50%)組裝的指標，以模擬群落為樣本，綜合考慮非生物過濾、競爭、環境噪聲和空間尺度，定量分析不同生態過程的相對貢獻[34]，NST使用R語言中的NST包計算，當使用模擬社區進行測試時，基于Jaccard指標的NST(NSTjac)顯示出比使用其他指標計算的NST更高的精度，并利用基于Bray-Curtis矩陣的NST(NSTbray)進一步驗證了NSTjac[34]。

2 結果與分析

2.1 河流沉積物理化性質特征

漢江上游干支流的沉積物理化性質如表1所示。秋季TN、TOC以及沉積物砂粒、黏粒、粉粒在不同河流之間具有顯著差異，但是TP的含量在不同河流之間并無顯著差異；春季TN、TP、TOC以及沉積物砂粒、黏粒含量在不同河流之間具有顯著差異，但是沉積物中的粉粒含量并無顯著差異。無論秋季還是春季，漢江上游干流的TN含量總是高于其他支流，TOC含量也高于大部分支流。

2.2 沉積物細菌群落多樣性與結構特征

對64個樣本(每個樣本24 929個ASVs)進行分析，由稀疏曲線(圖2)可知，隨著序列數量的增長，物種數趨于穩定，說明物種稀疏曲線趨向飽和，表明測序深度較為合理。由圖3可以看出，48 111個不同的ASVs，支流(37 845)的ASVs數量明顯多于干流(17 514)，2018年春季(30 601)的ASVs數量明顯多于2017年秋季(21 652)。

圖2 細菌豐度稀疏曲線Fig.2 Rarefaction curves of abundance of bacterial species

圖3 漢江上游干支流不同季節沉積物細菌分布韋恩圖Fig.3 Venn diagram of bacteria distribution in sediments of upper reaches of the Hanjiang River and its tributaries in different seasons

圖4為沉積物細菌門級類群相對豐度及其群落樹狀圖(平均豐度小于0.5%歸為其他)。秋季干流中豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria)(45.50%)，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)(12.66%)、藍藻門(Cyanobacteria)(6.76%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(5.34%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(3.35%)等；支流中豐度最高的為變形菌門(42.50%)，其次是藍藻門(16.66%)、擬桿菌門(13.15%)、浮霉菌門(7.16%)、酸桿菌門(2.53%)等，藍藻門在支流中的豐度高于干流。春季變形菌門仍然是豐度最高的菌門，且在干流中豐度最高的為變形菌門(33.31%)，其次為擬桿菌門(21.69%)、藍藻門(13.44%)、浮霉菌門(5.67%)、酸桿菌門(2.50%)等；支流中豐度變化與干流相差不大，依次為變形菌門(38.43%)、擬桿菌門(20.25%)、藍藻門(10.07%)、浮霉菌門(8.40%)、酸桿菌門(2.04%)等。

圖4 漢江上游干支流沉積物細菌門級類群相對豐度及其群落樹狀圖Fig.4 Relative abundance of Bacteriophylum taxa and their community trees in sediments of upper reaches of the Hanjiang River and its tributaries

圖5顯示了不同季節不同河段的Alpha指數差異，Chao1指數范圍為758～3 781，Shannon指數范圍為7.63～11.43。根據Mann-Whitney U檢驗顯示，秋季和春季的Shannon指數(P=0.053)和Simpson指數(P=0.217)差異不顯著，但Chao1指數(P<0.001)以及Pielou指數(P=0.005)具有顯著差異。秋季Shannon指數在金錢河與金水河之間具有顯著差異(P=0.022)，金水河與旬河(P=0.007)以及月河(P=0.030)之間具有顯著差異，其他河流之間并無顯著差異；Chao1指數在旬河與金水河(P=0.027)以及湑水河(P=0.016)之間具有顯著差異，其他河流之間并無顯著差異；Simpson指數(P=0.125)和Pielou指數(P=0.051)在干支流之間并無顯著差異。春季干支流之間的Shannon指數(P=0.226)、Simpson指數(P=0.277)、Pielou指數(P=0.206)和Chao1指數(P=0.185)并無顯著差異。

NMDS分析結果表明不同季節的細菌群落出現顯著分離(圖6)，秋季和春季的沉積物細菌群落結構在整體水平上不一致，ANOSIM統計檢驗結果證明了秋季和春季的細菌群落結構之間具有較高的分離度(R=0.676,P=0.001)，但是在干支流之間，無論是秋季(R=0.2102,P=0.001)還是春季(R=0.234 6,P=0.001)，細菌群落結構的分離度都不高。

2.3 理化因子對沉積物細菌群落的影響

細菌群落Bray-Curtis不相似性與地理距離之間的Spearman秩相關性表明(圖7)：秋季地理距離與細菌群落之間有顯著相關性，但春季并不具有顯著相關性；環境因子的歐氏距離與沉積物細菌群落的Bray-Curtis不相似性在秋季顯著相關，但是春季不相關(圖8)；地理距離與環境因子的歐氏距離之間的關系在季節之間并無明顯差異，秋季以及春季并未顯著相關(圖9)。基于Spearman秩相關的細菌群落Alpha多樣性與環境因子相關性分析顯示，無論在秋季還是春季，沒有環境因子與Shannon指數和Chao1指數有相關性(P>0.05)(圖10，圖中*、**、***分別表示在0.05、0.01和0.001水平(雙側)上顯著相關)。

(a) Shannon指數

圖6 基于Bray-Curtis相似性的不同季節細菌群落的NMDS分析Fig.6 NMDS analysis of bacterial communities in different seasons based on Bray-Curtis similarity

(a) 2017年秋季

2.4 基于NCM推斷中性過程對群落構建的影響

秋季和春季被NCM預測到的ASVs分別占97.5%和97.6%。另外，NCM表明隨機過程在很大程度上解釋了秋季(R2=0.807)和春季(R2=0.79)細菌群落的變異(圖11，圖中A為相對豐度，m為遷移率)。NSTjac和NSTbray也顯示了秋季(NSTjac為0.74，NSTbray為0.63)和春季(NSTjac為0.58，NSTbray為0.52)細菌群落主要受隨機過程(> 50%)的控制。總的來說，隨機過程對沉積物細菌群落的空間分布具有顯著影響。

(a) 2017年秋季

(a) 2017年秋季

(a) 2017年秋季

(a) 2017年秋季

3 討 論

沉積物細菌門級類群相對豐度及其群落樹狀圖(圖4)表明，無論是在支流還是干流中，變形菌門是相對豐度最高的優勢菌門，這與以往對河流細菌群落的研究相符[35-37]。秋季支流中藍藻門的豐度略高于擬桿菌門，主要是因為支流河床容易收集到更多的植物由于季節更替產生的營養物質，給沉積物中的藍藻門提供了良好的生存環境。Mann-Whitney U檢驗分析表明，不同季節之間Chao1指數和Pielou指數有差異顯著(圖5)。這與Sun等[38]先前對漢江浮游細菌的研究不同，漢江上游干流和支流的浮游細菌的Alpha多樣性指數只在干支流之間有顯著差異，季節之間沒有顯著差異。這是因為浮游細菌在水體中隨水流遷移，使支流中的細菌都在干流中匯集，導致干流和支流之間Alpha多樣性指數差異顯著，而沉積物并不會隨水流發生大范圍遷移。從圖4可以看出，同一季節的河流有著相似的群落結構，說明季節變化與群落結構變化有關。

NMDS分析結果表明，不同季節的沉積物細菌群落有清晰的分離模式，ANOSIM檢驗結果也清晰地反映出季節之間的差異性，說明不同季節群落結構有較大差異。由表1可知，不同采樣時期的環境因子有明顯差別，這是細菌群落季節性差異的一個因素，與Liu等[22]對長江的研究結果一致。由于內部和外部相互作用的存在，河流中細菌的季節性演替是一個每年重復的過程[21]。圖6顯示，干流的細菌群落與支流的細菌群落相差不大，這是沉積物的穩定性導致的，不同采樣點的沉積物環境有差異，而干流的采樣點相距較遠，與支流采樣點相比，更易受不確定性因素(如人為干擾)影響，如王佳等[39]對渾河沉積物研究發現，沉積物細菌群落結構從上游到下游具有明顯的區域分布特征，呈現由單一向復雜演替的趨勢。

Mantel檢驗分析顯示，秋季地理距離與沉積物細菌群落結構差異顯著，但春季時差異不顯著(圖7)，這可能是因為進入春季后氣溫逐步升高，不同河流的細菌開始大量繁殖，細菌群落未受到較大的影響，各個河流的細菌群落并未出現明顯的距離衰減模式，Mantel檢驗分析發現環境因子組合的歐氏距離與細菌群落之間只在秋季有顯著相關性，說明環境因子并不能完全解釋細菌群落結構的組成機制，這與以往的研究[12]有所區別，一方面可能是由于現有的環境因子不足，另一方面是因為河流沉積環境易受沿岸農業生產活動、植被、土地利用類型、水文、泥沙等多重因素的影響，部分河流干流及支流的生態狀況季節性差異大[40]。而且在秋季斷面調查中，支流調查斷面部分受到采石挖沙等人類活動的嚴重干擾，對溪流生物的群落結構和功能影響嚴重。由圖10可知，單個環境因子與細菌群落多樣性之間并無顯著相關性(P>0.05)，因此環境選擇代表的確定性過程并未對群落結構的形成產生顯著影響。而圖11表明，NCM對沉積物細菌群落有很大的解釋度(秋季R2=0.807，春季R2=0.790)，說明中性過程在群落組裝的構建過程中起到了關鍵性作用。中性理論認為群落中所有的物種具有相同的競爭和擴散能力，因此群落的組成受隨機漂移的影響，即隨機過程塑造了微生物群落結構[41]。NST結果表明，隨機過程在季節內沉積物細菌群落構建中發揮了重要作用，其可能易受隨機過程的影響而不是受環境選擇代表的確定性過程的影響，這一結果驗證了NCM的結論。沉積物細菌群落的形成受隨機過程主導是因為沉積物樣點本身具有一定的區域異質性，沉積物環境的改變主要靠營養鹽的沉降擴散過程以及重金屬的吸附、富集等過程，采樣點之間環境因子的變化不具有規律性，沉積物的理化性質在干支流間差異較大，因此環境因子對群落的影響較小；干流和支流生態狀況較差，較強的人為干擾破壞了河流連續體細菌群落結構的生態演替，可能會削弱環境選擇的影響，所以群落結構的形成更易受到漂移等不由環境決定的隨機過程的影響。但與其他河流的類似研究結果[23,42-43]不一致。

對漢江上游流域的保護，不僅要考慮常規的環境因子對該流域微生態的影響，還要考慮人為干擾對環境的影響，加強河道保護，對采石挖沙等工程嚴格管控，維護河流連續體正常的生態演替。

4 結 論

a.漢江上游干支流沉積物細菌群落存在明顯的季節變化，Alpha多樣性指數表明春季細菌群落豐富度和多樣性較高，不過在春秋兩個季節中，變形菌門都是豐度最高的優勢菌門；干流和支流之間的細菌群落結構具有顯著差異。

b.根據中性理論，群落中所有的物種具有相同的競爭和擴散能力，因此群落的組成受隨機漂移的影響。中性群落模型對群落構建有較高的解釋度，因此在群落構建過程中，以隨機漂移為主的隨機過程主導了細菌群落的形成。

c.標準化隨機率顯示無論是基于Jaccard指標還是基于Bray-Curtis矩陣的算法，隨機過程(NST大于50%)都對細菌群落的構建起著重要作用。