肉牛Myostatin 基因編輯育種研究

魏著英 白春玲 楊磊 蘇廣華 武云喜 張立 李光鵬

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院暨省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

牛的自然壽命一般在15～20 年，妊娠期280d 左右，生長期需要2～4 年，在人工選擇下培育一個肉牛新品種需要30～50 年。在我國，黃牛長期發(fā)揮役用功能，其肉用性能不足，主要表現(xiàn)為體型小、生長慢、產(chǎn)肉率低。國際知名的肉牛品種如安格斯牛、海福特牛、夏洛來牛、利木贊牛、皮埃蒙特牛及和牛等均為經(jīng)幾十年培育而成的優(yōu)良肉用品種，廣泛用于國際大規(guī)模集約化飼養(yǎng)，經(jīng)濟性能顯著優(yōu)于我國黃牛品種。為提升我國黃牛的肉用性能，本實驗室歷時15年，以蒙古牛、魯西牛和西門塔爾牛為對象，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，對調(diào)控肌肉發(fā)育的抑肌基因（Myostatin，MSTN）進(jìn)行編輯，成功培育出生長速度、屠宰率與凈肉率顯著提升的“雙肌魯西牛”、“雙肌蒙古牛” 和“雙肌西門塔爾牛” 新品系[1]。該文以魯西牛為例，介紹MSTN 基因編輯牛培育過程。

1 MSTN 基因編輯位點的選擇

MSTN 是TGFβ 超家族成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的調(diào)控肌肉發(fā)育效率最高的單基因，主要參與骨骼肌細(xì)胞增殖與分化。突變后的MSTN 基因減弱了抑制肌纖維生長和增殖的功能，突變動物表現(xiàn)為肌肉發(fā)達(dá)的“雙肌” 表型。

在MSTN 基因自然突變牛中，利木贊牛的MSTN突變位點在第一外顯子282bp（C→A），德國黃牛在第一外顯子191bp（T→C），夏洛萊牛發(fā)生于第二外顯子238bp（C→T），阿奎坦牛在第二內(nèi)含子1234bp處發(fā)生了T→G 的突變，皮爾蒙特牛的突變發(fā)生在第三外顯子938bp（G→A），比利時藍(lán)牛在第三外顯子缺失了821～831bp 的11 個堿基[2]。突變對MSTN 基因的表達(dá)及蛋白活性造成顯著影響，但不同突變位點的遺傳效應(yīng)有差異。第一或第二外顯子主要編碼MSTN 蛋白的信號肽和前肽，突變后對胎兒期的骨骼肌發(fā)育影響較小，難產(chǎn)率顯著低于第三外顯子突變牛。因此，我們以牛MSTN 第一外顯子和第二外顯子為目標(biāo)區(qū)域，結(jié)合CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，最終選擇第一外顯子區(qū)的g.507del(6)和g.505del(115)位點、第二外顯子的g.3942T>G 位點和g.415C>A 位點，以魯西牛和蒙古牛為對象，分別對其MSTN 基因進(jìn)行編輯改造，以使MSTN 基因突變效應(yīng)發(fā)揮到適當(dāng)水平，使所培育的編輯牛的生長速度與產(chǎn)肉率適中，避免引起器官變化與免疫變化，避免因難產(chǎn)造成的損失[2,3]。

2 原代MSTN 基因編輯牛培育

以魯西牛為例，構(gòu)建CRISPR/Cas9 基因編輯打靶載體，將打靶載體轉(zhuǎn)染入胎兒成纖維細(xì)胞，篩選得到MSTN 第一外顯子g.507del(6)或g.505del(115)位點缺失突變的基因編輯的陽性細(xì)胞；對基因編輯細(xì)胞進(jìn)行DNA、mRNA 和蛋白質(zhì)功能表達(dá)分析[3]；繼而通過克隆技術(shù)生產(chǎn)MSTN 基因編輯胚胎120 枚，移植到62頭受體中，9 頭受體牛妊娠，產(chǎn)下8 頭基因編輯雄性犢牛，其中6 頭健康發(fā)育、體況良好，用于采精和系祖公牛[3-4]。

3 MSTN 基因編輯肉牛新品系培育

以原代基因編輯公牛作為系祖，通過人工輸精與普通魯西牛母牛配種，進(jìn)行新品系培育。以1 號系祖雙肌魯西公牛精液對普通魯西母牛進(jìn)行配種，生產(chǎn)F1代；然后使用2 號系祖公牛的精液與F1代配種，獲得F2代。挑選性狀表型優(yōu)秀的F2代公牛與F1或F2代母牛進(jìn)行配種選育，最終獲得基因型與表型穩(wěn)定的雙肌魯西牛核心群。在選育過程中，動態(tài)監(jiān)測各代次雙肌牛的體重與體尺、血液生理生化等指標(biāo)，開展育肥試驗及屠宰試驗等，收集育種數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

3.1 生長性狀

除具備普通魯西牛典型的“三粉” 特征外，雙肌魯西牛的前軀更加發(fā)達(dá)，后軀呈現(xiàn)典型的雙肌表型，軀體呈寬大的矩形；耆甲部位發(fā)達(dá)。F2代雙肌牛較F1代的肉牛特征更加顯著。尤其是公牛，肩峰高而寬厚，胸深而寬，肌肉發(fā)達(dá)，軀體呈典型矩形（圖1）。

圖1 雙肌魯西公牛

體重是衡量生長的直接指標(biāo)。24 月齡時，F(xiàn)1代雙肌魯西公牛的平均體重為510kg，F(xiàn)2代雙肌公牛的平均體重為530kg，而普通魯西公牛的體重為440kg 左右；F1代雙肌魯西母牛的體重為396kg，F(xiàn)2代雙肌母牛的體重為402kg，而普通母牛的體重為366kg。可以看出，MSTN 基因編輯牛的增重效應(yīng)顯著，雙肌魯西牛的體重增速，體高、十字部高、體長、肩寬、髖寬、胸圍等指標(biāo)均優(yōu)于同月齡對照魯西牛[4]。

3.2 健康狀況

通過持續(xù)監(jiān)測雙肌魯西牛的血常規(guī)和血液生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，除淋巴細(xì)胞比率、中值細(xì)胞計數(shù)與普通魯西牛存在差異外，其他指標(biāo)如血小板計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白等與對照牛之間無顯著性差異。血清生理生化指標(biāo)中高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂肪酶、葡萄糖、α-淀粉酶等糖、脂和蛋白質(zhì)的代謝相關(guān)的指標(biāo)都發(fā)生了變化，但是各項指標(biāo)值均在正常生理范圍內(nèi)（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。另外，為檢測雙肌魯西牛的運動適應(yīng)能力，讓牛群跑起來模擬力竭運動，觀察監(jiān)測雙肌牛的表現(xiàn)。結(jié)果不負(fù)眾望，無論是空腹運動還是飽食后運動，雙肌牛均并未出現(xiàn)猝死、暈厥、嘔吐等不良癥狀，各項血液指標(biāo)均正常[5]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)雙肌牛的抗氧化能力顯著提升，這也是其健康的又一力證[6-7]。以上實驗均說明雙肌魯西牛擁有良好的健康體況，而且其生理代謝機能與普通牛略有不同，更適應(yīng)其肌肉發(fā)達(dá)的表型[5-7]。

3.3 產(chǎn)肉與肉質(zhì)性能

為檢驗雙肌魯西牛的肉用性能，我們進(jìn)行了育肥與屠宰試驗。從屠宰數(shù)據(jù)可以看出，從18 月齡育肥至24 月齡后，雙肌牛體重可達(dá)到662kg，胴體重402kg，屠宰率為60.8%，凈肉率達(dá)到40.6%；對照牛平均活體重為615kg，胴體重350kg，屠宰率為55.7%，凈肉率為37.6%，差異顯著。同時檢測了眼肉、米龍、上腦、腱子、里脊、外脊等部位的肉品質(zhì)，各部位肌肉的pH、嫩度、系水力、含水量、脂肪酸、氨基酸和微量元素等均與對照魯西牛肉無統(tǒng)計學(xué)差異。說明MSTN 基因突變牛的生長與產(chǎn)肉性能較普通牛顯著提高，肉品質(zhì)并沒有下降[3]。

3.4 MSTN 基因突變促進(jìn)肌肉發(fā)育的機制分析

上述數(shù)據(jù)表明，MSTN 基因突變后，黃牛的各項生長指標(biāo)、肌肉發(fā)育、產(chǎn)肉性能等均大幅高于普通黃牛。為此，我們開展了一系列機制性研究，解析MSTN 基因編輯牛性狀改善的生理學(xué)分子機制[6-11]。MSTN 基因突變，影響細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)，通過與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白I 型膠原α1（Collagen Type I Alpha 1，COL1A1)基因相互作用，調(diào)控黏合斑、PI3K-AKT 和核糖體途徑，促進(jìn)肌肉發(fā)育和生長[9]；MSTN 突變通過Smad2/Smad3 激活去甲基化酶TET1，促進(jìn)成肌因子去甲基化，提高肌纖維融合[8]；MSTN 突變激活了心肌細(xì)胞PDE5A-cGMP-PKG 途徑，增強PFK 磷酸化，促進(jìn)心肌糖酵解反應(yīng)，提高牛心肌代謝[10]；MSTN 基因突變誘使牛胃腸道平滑肌發(fā)育，促進(jìn)腸道蠕動，并改變胃腸道菌群組成[12-13]；MSTN突變引起肝臟初級膽汁酸生物合成增加和膽汁分泌途徑信號顯著上調(diào)，提高了脂代謝能力[11]；MSTN 突變顯著提高了牛的抗氧化應(yīng)激能力[6,7]。相關(guān)研究工作仍在持續(xù)深入。由此可知，MSTN 基因突變促進(jìn)肌肉發(fā)育是機體全身性與整體性發(fā)生遺傳效應(yīng)的結(jié)果，我們將多角度、全方位的揭示MSTN 的作用機制，為育種提供翔實的理論支撐。

4 結(jié)語和展望

基因編輯牛的生長速度、體型外貌與產(chǎn)肉性能顯著高于同品種普通黃牛，突破了黃牛品種體型小、生長慢、產(chǎn)肉率低的肉用性狀瓶頸，初步系統(tǒng)揭示了基因編輯牛性狀改善的生理學(xué)分子機制。近年來，在國家科技重大專項支持下，我國科學(xué)家利用CRSPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制了一大批具有實際育種潛力的基因編輯羊[14-24]、豬[25-34]和牛[4,35-36]，這些動物的表型均符合目標(biāo)預(yù)期。可以說，我國在基因編輯豬、牛、羊育種研究方面已經(jīng)位居世界前列。

隨著自主基因編輯新技術(shù)的研發(fā)，我國在大動物生物育種方面必將迎來更大的進(jìn)步。