基于網絡藥理學的荔枝核抗肝纖維化作用機制研究▲

黃菊芳 張揚武 黎敏航 羅 婷 羅偉生

(1 廣西中醫藥大學研究生院，廣西南寧市 530001； 2 廣西中醫藥大學瑞康臨床醫學院， 廣西南寧市 530011)

肝纖維化是肝內纖維組織異常增生，肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化，細胞外基質大量產生、沉積并出現合成與降解失衡，繼發肝臟自我修復的動態可逆性病理過程[1]。肝纖維化會損害肝組織的結構和功能，其若得不到阻抑或逆轉則可能進展為失代償期肝硬化，并導致各種終末期肝病相關并發癥的發生，如消化道出血、感染、肝性腦病、肝腎綜合征等，進而嚴重影響患者生存質量和預后，甚至導致死亡[2]。如在早期階段給予有效的治療，肝纖維化具有可逆性[3]。研究表明，中藥可通過抑制HSC活化[4]與肝內炎癥反應[5]，調節脂肪細胞因子[6]，以及調控氧化應激[7]等方式，發揮延緩肝纖維化的作用。因此，從中醫藥中尋找有效的抗肝纖維化藥物具有必要性和重要性。荔枝核為無患子科荔枝屬植物荔枝的干燥成熟種子，味甘、微苦，性溫，歸肝、腎、胃經，具有行氣散結、祛寒止痛的作用[8]。荔枝核的主要成分包括荔枝核皂苷、揮發油、總黃酮、糖類等[9]。研究表明，荔枝核總黃酮為抗肝纖維化的主要有效活性成分[10-11]。本課題組前期研究提示，荔枝核總黃酮通過調節轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)[12]、基質金屬蛋白酶抑制劑-1[13]及過氧化物酶體增殖物激活受體γ/c-Ski[14]等信號通路的表達來減輕肝細胞的損傷，達到抗肝纖維化的作用。但是肝纖維化涉及的細胞分子機制極其復雜，目前荔枝核抗肝纖維化的相關活性成分有待進一步開發。網絡藥理學旨在研究藥物、疾病、靶標三者之間復雜多樣的關系，為中醫藥的傳承創新提供了一種新方法。故本文采用網絡藥理學方法，從整體性的角度對荔枝核抗肝纖維化作用機制進行探討，為深入研究荔枝核及含荔枝核的中藥復方的抗肝纖維化作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢索荔枝核有效活性成分 以“荔枝核”為檢索詞，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索荔枝核的活性成分，設定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為主要有效活性成分的篩選條件[15]，獲取荔枝核的有效活性成分，并將結果導入Excel表格。

1.2 預測荔枝核主要有效活性成分的作用靶點 采用 Perl 軟件(https://www.perl.org/)對荔枝核有效成分的作用靶點進行預測，然后利用UniProt在線蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)查找作用靶點對應的標準基因名。

1.3 篩選肝纖維化相關靶點 在GeneCards?數據庫(https://www.genecards.org)、OMIM?數據庫 (https://omim.org)中，以“liver fibrosis”“fibrosis”“hepatofibrosis”為關鍵詞獲取肝纖維化相關靶點，去除重復靶點。

1.4 獲取荔枝核-肝纖維化靶點 通過微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)將肝纖維化相關靶點和荔枝核有效成分的作用靶點取交集，繪制韋恩圖，得到荔枝核-肝纖維化靶點，即荔枝核抗肝纖維化的靶點。

1.5 構建“中藥-活性成分-基因靶點-疾病”網絡 將1.2獲得的荔枝核主要有效成分的作用靶點和1.4獲得的荔枝核-肝纖維化靶點輸入Perl軟件進行映射，然后運用CytoScape軟件3.7.0進行可視化分析，得到“中藥-活性成分-基因靶點-疾病”網絡圖。

1.6 建立蛋白-蛋白相互作用網絡及篩選核心基因 在STRING數據庫(http://string-db.org/)中輸入荔枝核-肝纖維化靶點，選擇多種蛋白質，限定研究生物為“homosapiens”，將獲得的tsv文件導入CytoScape軟件構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡圖，將tsv的文件輸入R語言軟件3.6.1(https://www.r-project.org/)并運行，根據鄰接節點數目，得到PPI網絡核心基因。

1.7 功能和通路富集分析 將荔枝核-肝纖維化靶點輸入R語言軟件3.6.1，進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析(主要分析生物學過程)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析。

2 結 果

2.1 荔枝核的主要有效活性成分 利用TCMSP平臺檢索到荔枝核的有效成分72個，根據設定的OB和DL進行篩選，共獲得荔枝核的有效活性成分 8個，見表1。

表1 荔枝核的主要有效活性成分

2.2 荔枝核-肝纖維化靶點 獲得荔枝核主要有效活性成分的作用靶點87個，以及肝纖維化相關靶點6 899個，將兩者取交集，得出79個荔枝核-肝纖維化靶點，包括前列腺內過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)3、CHRM1、CHRM2、腎上腺素受體α1A(adrenoceptor alpha 1A，ADRA1A)、煙堿型乙酰膽堿受體α1亞單位(cholinergic receptor nicotinic alpha 1 subunit,CHRNA2)等。見圖1。

圖1 荔枝核-肝纖維化靶點的韋恩圖

2.3 “中藥-活性成分-基因靶點-疾病”網絡 “中藥-活性成分-基因靶點-疾病”網絡見圖2，圖中橘色代表肝纖維化，紫色代表荔枝核，藍色代表荔枝核的主要有效活性成分，黃色代表荔枝核-肝纖維化靶點；由圖2可知，荔枝核主要通過6種有效活性成分(甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、表兒茶素、槲皮素)作用于79個荔枝核-肝纖維化靶點，從而發揮干預肝纖維化的作用。

圖2 中藥-活性成分-基因靶點-疾病”網絡圖

2.4 PPI網絡及核心基因 利用CytoScape軟件構建PPI網絡圖，見圖3。共篩選出30個核心基因，根據鄰接節點數目由多到少排序為白細胞介素(interleukin,IL)-6、Caspase-3、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、MYC、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、細胞周期蛋白(cyclin D1)、FOS、Erb-B2 受體酪氨酸激酶2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2,ERBB2)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、RELA、過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)3、孕激素受體(progesterone receptor,PGR)、Caspase-8、陷窩蛋白1(caveolin 1,CAV1)、缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)1A、芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AHR)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、Caspase-9、核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor,erythroid 2 like 2,NFE2L2)、核因子κB抑制因子α(nuclear factor kappa-B inhibitor alpha，NFKBIA)、細胞色素P450家族3亞家族A成員4(cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4,CYP3A4)、NAD(P)H苯醌脫氫酶1 [NAD(P)H quinone dehydrogenase 1,NQO1]、RB1、cyclin B1、熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)B1、胰島素生長因子2(insulin growth factor 2,IGF2)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1,PARP1)、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)，見圖4。

圖4 PPI網絡核心基因

2.5 GO富集分析結果 荔枝核-肝纖維化靶點共參與了101個生物學過程，主要為RNA聚合酶Ⅱ特異性、DNA結合轉錄激活因子活性、核受體的活動、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、激活轉錄因子結合、乙酰膽堿受體的活動、類固醇結合、泛素樣蛋白連接酶結合、谷胱甘肽結合、突觸后神經遞質受體活動等，見圖5。

圖5 GO 功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路分析結果 荔枝核-肝纖維化靶點共涉及74條信號通路，涉及的信號通路主要與炎癥途徑密切相關，如人類巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、細胞凋亡、HIF-1、腫瘤壞死因子、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、EB病毒感染、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、甲型流感、p53等信號通路。見圖6。

圖6 KEGG通路分析柱狀圖

3 討 論

中醫藥是一個多組分的藥物協同體系，針對不同疾病具有獨特的治療作用。本研究應用網絡藥理學方法，通過TCMSP數據庫篩選出荔枝核的8個主要有效活性成分，以及主要有效活性成分的作用靶點87個；在GeneCards?、OMIM?數據庫中得到肝纖維化相關靶點6 899個，與荔枝核主要有效活性成分的作用靶點取交集后，得到荔枝核抗肝纖維化的靶點79個，荔枝核抗肝纖維化的可能關鍵成分6個，分別為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、甘露醇、谷甾醇、表兒茶素。槲皮素屬于黃酮類天然化合物，廣泛存在于自然界的水果、中草藥及綠葉蔬菜。研究表明，槲皮素具有抗癌[16]、治療糖尿病[17]、抗氧化[18]等作用。Wu等[19]研究發現，槲皮素可通過調節TGF-β1/Smads與PI3K/AKT通路之間的連接來減弱HSC的活化并減少自噬，并促進基質降解，從而預防了肝纖維化的發生和發展。Li等[20]研究發現，黃酮類槲皮素通過抑制巨噬細胞浸潤并通過靶向(Notch受體1，NOTCH1)途徑調節M1型巨噬細胞極化，從而減輕肝臟炎癥和纖維化。這說明槲皮素可通過抑制HSC的活化而成為抗纖維化的潛在藥物。β-谷甾醇是一種類膽固醇的植物甾醇，可從各種植物中提取獲得。Kim等[21]研究發現，β-谷甾醇通過對肝纖維化基因的mRNA、蛋白質表達水平的調節，以減輕肝纖維化小鼠的肝臟損傷并防止膠原蛋白積聚，也可通過抑制氧化應激和HSC活化標志物來發揮抗肝纖維化的作用[22]，這表明β-谷甾醇可能是肝纖維化的潛在治療劑。有研究表明，豆甾醇對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化具有改善作用[23]。總之，荔枝核的多種有效活性成分具有一定的抗肝纖維化作用。

本研究通過PPI網絡可知，荔枝核抗肝纖維化的核心靶點包括IL-6、Caspase-3、EGFR、VEGFA、MYC、ESR1、cyclin D1、FOS、ERBB2、AR、RELA、PPARG、NOS3、PGR等。有研究表明，通過下調依賴于IL-17A的IL-6/信號轉導及轉錄激活因子3信號通路可以改善肝纖維化[24]；通過調節Caspase-3/活化型Caspase-3蛋白來抑制B細胞淋巴瘤2蛋白的表達，可誘導HSC凋亡，達到預防肝細胞損傷的目的[25]；誘導型NOS的表達水平升高而內皮型NOS的表達水平降低，與肝纖維化中氧化應激標志物的升高密切相關[26]；激活蛋白1轉錄因子亞基FOS相關抗原1(FOS like 1,activator protein-1 transcription factor subunit，Fra-1)與肝纖維化有關[27]。此外，Fra-1的表達升高可以防止對乙酰氨基酚引起的肝損傷[28]。由此可見，上述這些靶標都有可能是荔枝核抗肝纖維化的主要調節因子。

本研究KEGG通路分析結果顯示，荔枝核抗肝纖維化的靶點涉及p53、PI3K/AKT、HIF-1等信號通路。p53信號通路在多種疾病，尤其是腫瘤疾病中起重要作用[28]。肝細胞中p53信號的激活會導致細胞凋亡，從而激活HSC，是肝纖維化的啟動因子，而抑制p53信號通路的傳導對肝細胞具有保護作用[29]。p53可促進HSC鐵死亡的上游分子，而通過小干擾RNA技術下調p53基因可阻斷HSC的鐵死亡，進而加重肝纖維化[30]。PI3K/AKT通路參與調節HSC活化和增殖、膠原蛋白合成，促進肝纖維化的進展[31]。體外實驗研究表明，通過下調PI3K/AKT信號通路可顯著抑制HSC增殖，其有可能成為臨床抗纖維化治療的靶點[32]。纖維化酶賴氨酰氧化酶是一種分泌型胺氧化酶，可催化細胞外基質中膠原纖維之間共價交聯的形成，組織缺氧及其他刺激會增加纖維化酶賴氨酰氧化酶的表達，而這一過程主要由HIF-1主導[33]。肝纖維化可能與肝細胞缺氧相關，而纖維化酶賴氨酰氧化酶和相關蛋白可能在肝纖維化的發展中起到關鍵作用[34]。

綜上所述，荔枝核抗可能通過甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、表兒茶素、槲皮素等有效活性成分，干預多靶點、調節多條信號通路來達到抗肝纖維化的效果。本研究結果或可為荔枝核治療肝纖維化提供一定的依據，也可為臨床抗肝纖維化及中藥的開發提供一定的思路。然而，本研究仍存在一些不足之處：首先，本研究僅基于肝纖維化的現有靶點進行分析，這可能會遺漏一些作用于新治療靶點的中藥活性成分；其次，本研究不能區分一種成分是直接與靶點結合還是間接影響靶點。深入、系統地探討荔枝核抗肝纖維化的機制研究，以及開展高質量的實驗研究，將是今后進一步研究的方向。