正丁酸鈉對肺腺癌細胞增殖、凋亡和Notch信號通路的影響

羅美玲 廖小娟

(1 郴州市第一人民醫院呼吸內科，湖南省郴州市 423000； 2 湖南中醫藥大學第二附屬醫院中醫科，湖南省長沙市 410005)

近年來，隨著環境污染的加劇及吸煙人數的急劇上升，肺癌患者逐年增加，肺腺癌已經成為我國最常見的肺癌類型之一[1-2]。目前肺腺癌的治療方法主要以手術治療及放化療為主[3-4]。臨床上常使用相關藥物輔助化療，以增強化療對癌細胞的殺傷能力。正丁酸鈉是具有提高組蛋白乙酰化水平的組蛋白去乙酰化抑制劑，Shi等[5]發現，正丁酸鈉可以抑制胃癌細胞的增殖和遷移；羅娟等[6]發現，正丁酸鈉可以抑制宮頸癌細胞的增殖并促進其凋亡；劉恒銚等[7]的研究表明，肺癌的惡性生物學特征與Notch信號通路關系密切。因此，我們推測正丁酸鈉對肺腺癌細胞的增殖和凋亡也有一定的影響，其作用機制可能與Notch信號通路相關。故本研究探討正丁酸鈉對肺腺癌細胞增殖、凋亡和Notch信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 肺腺癌細胞購于中國科學院細胞庫；正丁酸鈉購自Aladdin公司(CAS號：107-92-6；產品編號：B110442)，Ki-67抗體(貨號：ab205718)、增殖性細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(貨號：ab205871)、Notch受體1(NOTCH1)抗體(貨號：ab52627)、Hes家族BHLH轉錄因子1(Hes family BHLH transcription factor 1，HES1)抗體(貨號：ab108937)、周期素D3(cyclin D3)抗體(貨號：ab183338)，GAPDH(貨號：ab8245)均購自Abcam公司，B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(貨號：sc-7382)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(貨號：sc-7480)均購自Santa Cruz公司，MTT試劑(貨號：YB111105-500)購自Ybscience公司，RPMI 1640 培養基、胎牛血清均購自HyClone公司，二甲基亞砜(貨號：D2650)購自Sigma公司，Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：XG-X6556)購自上海西格生物科技有限公司，碘化丙啶(貨號：YT8633)購自北京伊塔生物科技有限公司。WMJ-9688正置金相顯微鏡購自上海無陌光學儀器有限公司，CytoFLEX流式細胞儀購自貝克曼有限公司，SpectraMax iD3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及傳代：肺腺癌細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，細胞融合約90%時傳代培養，取第3代細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測正丁酸鈉對肺腺癌細胞生長抑制效果：將肺腺癌細胞以5 000個/孔的密度接種于96個孔板中，細胞貼壁生長后每孔分別加入正丁酸鈉，使其終濃度分別為0 mmol/L、1.25 mmol/L、2.50 mmol/L、5.00 mmol/L、10.00 mmol/L、20.00 mmol/L、40.00 mmol/L，置于培養箱繼續培養(培養條件同1.2.1)，分別于培養24 h、48 h、72 h后加入10 μL MTT溶液孵育4 h，再加入100 μL二甲基亞砜孵育0.5 h，使用SpectraMax iD3型酶標儀檢測570 nm波長處的光密度(A)值。計算抑制率，抑制率=[(1-不同濃度正丁酸鈉組A值)/0 mmol/L正丁酸鈉組A值]×100%。實驗重復6次。

1.2.3 分組及藥物干預：根據1.2.2肺腺癌細胞生長抑制情況，將5.00 mmol/L、10.00 mmol/L、20.00 mmol/L正丁酸鈉作為后續實驗的干預濃度，干預時間為72 h(實驗組)；同時設置對照組，不進行任何干預。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達水平：提取1.2.3干預后的各組肺腺癌細胞總蛋白[8]，采用Bradford法測定各組細胞蛋白濃度，取70 μg蛋白，通過SDS-PAGE分離等量蛋白并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫密封2 h， TBST洗膜4次，10 min/次，然后加入Ki-67抗體、PCNA抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、NOTCH1抗體、HES1抗體、cyclin D3抗體和GAPDH抗體(均加入8 mL，稀釋比均為1 ∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜4次，10 min/次，加入8 mL經辣根過氧化物酶標記的上述抗體二抗(稀釋比為1 ∶500)，室溫繼續孵育1 h，TBST洗膜4次，10 min/次，化學反應顯影曝光后，采用DNR Bio Imaging System軟件分析目標蛋白與內參蛋白GAPDH條帶的灰度值比值。實驗重復6次。

1.2.5 克隆形成實驗：取1.2.3處理后的各組肺腺癌細胞，培養2周(培養條件同1.2.1)，多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色30 min，然后在顯微鏡下統計克隆細胞數目，克隆形成率=(實驗組克隆細胞數目/對照組克隆細胞數目)×100%。實驗重復6次。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率：取1.2.3處理后的各組肺腺癌細胞，使用0.25%不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶對細胞進行消化2 min，在4 ℃下以1 000 r/min離心5 min后棄上清，用PBS清洗2次(1 min/次)后再加入Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annex Ⅴ-FITC和10 μL 碘化丙啶，避光靜置30 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism 5軟件進行圖像處理。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復測量資料的比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度正丁酸鈉對肺腺癌細胞的抑制效果 各組肺腺癌細胞的抑制率比較，差異有統計學意義(F組間=3 632.000，P組間<0.001)；各組肺腺癌細胞的抑制率均有隨培養時間增長而升高的趨勢(F時間=106.800，P時間<0.001)；分組與時間有交互效應(F交互=18.860，P交互<0.001)。其中，培養24、48、72 h后，5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組、40.00 mmol/L正丁酸鈉組肺腺癌細胞的抑制率均高于0 mmol/L正丁酸鈉組(均P<0.05)；5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組、40.00 mmol/L正丁酸鈉組肺腺癌細胞培養72 h后的抑制率均高于同劑量組培養24 h和48 h后的抑制率(均P<0.05)，見表1。由此說明正丁酸鈉作用72 h后，對肺腺癌細胞的抑制效果較24 h、48 h更顯著，且正丁酸鈉濃度為5.00 mmol/L、10.00 mmol/L、20.00 mmol/L時，表現出快速抑制肺腺癌細胞生長的趨勢，故選擇上述濃度和作用時間作為后續實驗的干預條件。

表1 不同濃度正丁酸鈉對肺腺癌細胞抑制率的比較(x±s，%)

2.2 正丁酸鈉對肺腺癌細胞增殖相關蛋白表達水平及克隆形成率的影響 對照組、5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組的Ki-67、PCNA蛋白表達水平和克隆形成率均依次降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

圖1 不同濃度正丁酸鈉組肺腺癌細胞的克隆形成情況

圖2 不同濃度正丁酸鈉組肺腺癌細胞增殖相關蛋白的表達情況

表2 不同濃度正丁酸鈉組肺腺癌細胞增殖相關蛋白相對表達水平及克隆形成率的比較(x±s)

2.3 正丁酸鈉對肺腺癌細胞凋亡相關蛋白表達水平及凋亡率的影響 對照組、5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組的Bax蛋白表達水平、細胞凋亡率均依次升高，Bcl-2蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 不同濃度正丁酸鈉組肺腺癌細胞凋亡相關蛋白的表達情況

表3 不同濃度正丁酸鈉組肺腺癌細胞凋亡相關蛋白相對表達水平及凋亡率的比較(x±s)

2.4 正丁酸鈉對肺腺癌細胞Notch信號通路相關蛋白的影響 對照組、5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組的NOTCH1、HES1和cyclin D3蛋白表達水平均依次降低(均P<0.05)。見圖4和表4。

圖4 不同濃度正丁酸鈉組肺腺癌細胞Notch信號通路相關蛋白的表達情況

表4 不同濃度正丁酸鈉組肺腺癌細胞Notch信號通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌是肺癌的主要病理類型，肺腺癌屬于非小細胞肺癌[9]。肺癌的病死率較高，其原因與肺癌細胞的惡性生物學特征，尤其是肺癌細胞的惡性增殖有關[10]。本研究結果顯示，隨著藥物濃度的升高和培養時間的增長，正丁酸鈉對肺腺癌細胞的抑制率逐漸升高(P<0.05)，說明正丁酸鈉可抑制肺腺癌細胞的生長，且具有濃度依賴性和時間效應。

腫瘤細胞的惡性生長是增殖、凋亡和侵襲等多種因素影響的結果，受到細胞增殖、細胞周期等相關基因和蛋白的調節[11]。研究表明，PCNA參與細胞周期的調控過程，Ki-67是反映細胞G1～S期增殖狀態的敏感標志物，兩者均可反映細胞增殖能力[12-13]。本研究結果顯示，干預72 h后，對照組、5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組的Ki-67、PCNA蛋白表達水平和克隆形成率均依次降低(均P<0.05)，與既往研究結果[14]相似，說明正丁酸鈉可能是通過抑制PCNA、Ki-67蛋白的表達水平來發揮抑制肺腺癌細胞增殖的作用。

加快腫瘤細胞凋亡可以抑制其惡性生物學行為[15]，細胞凋亡受多種基因、蛋白和信號通路的調節，包括Caspase、Bcl-2蛋白家族[16]，而Bcl-2和Bax蛋白互相拮抗并共同調節細胞凋亡途徑[17]。本研究結果顯示，干預72 h后，對照組、5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組的Bax蛋白表達水平、細胞凋亡率均依次升高，Bcl-2蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)，與既往研究結果[6,18]相似，說明正丁酸鈉可以通過調節Bcl-2家族蛋白表達水平來誘導肺腺癌細胞凋亡。

Notch信號通路參與細胞的生長、發育過程[19]。有研究表明，某些轉錄因子可以通過調節Notch信號通路加快肺腺癌的進展[20]。NOTCH1是Notch受體之一，刺激NOTCH1可以提高表皮生長因子受體的表達水平，從而促進腫瘤細胞的增殖[21]。在腫瘤細胞增殖過程中，cyclin D3蛋白是重要的周期蛋白，可以啟動細胞周期的G1/S期，促進細胞的過度增殖[22]。HES1是典型的 Notch信號通路抑制因子，也是評估Notch信號通路活性的重要標志物。Notch可促進HES1誘導磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路的激活，抑制腫瘤細胞凋亡[23]。本研究結果顯示，干預72 h后對照組、5.00 mmol/L正丁酸鈉組、10.00 mmol/L正丁酸鈉組、20.00 mmol/L正丁酸鈉組的NOTCH1、HES1和cyclin D3蛋白表達水平均依次降低(P<0.05)，說明正丁酸鈉可能通過抑制Notch信號通路相關蛋白的表達，發揮抑制肺腺癌細胞增殖的作用。

綜上所述，正丁酸鈉可抑制肺腺癌細胞的生長、增殖并促進其凋亡，這可能與其抑制增殖相關蛋白和Notch信號通路相關蛋白的表達，以及促進凋亡相關蛋白的表達有關。